[發明專利]用于增加革蘭氏陽性菌翻譯起始位點的序列及其在提高蛋白表達效率中的應用

有效

• 申請號: 202110392656.2
• 申請日: 2021-04-13
• 公開（公告）號: CN113106095B
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: 王勤;陳守文;張曼玉;蔡東波;肖軍;宋靜
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/75;C12N15/77;C12N15/67
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發明屬于基因工程和微生物工程技術領域，公開了用于增加革蘭氏陽性菌翻譯起始位點的序列及其在提高蛋白表達效率中的應用，所述的序列為SEQ ID NO.1所示。本發明通過改造啟動子的5’非翻譯區，從而促使目的基因從多個翻譯起始位點進行翻譯。在地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌中，綠色熒光蛋白的表達量較原始啟動子P43啟動子分別提高了約150倍和126倍。在谷氨酸棒桿菌中，綠色熒光蛋白的表達量較原始啟動子提高了36倍。同時，該mRNA前導序列也顯著提高了地衣芽孢桿菌中角蛋白酶的表達量，證明了該序列對于提高革蘭氏陽性菌蛋白表達效率的普適性。

技術領域

本發明涉及基因工程和微生物工程技術領域，具體涉及用于增加革蘭氏陽性菌翻譯起始位點的序列及其在提高蛋白表達效率中的應用。

背景技術

地衣芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌以及谷氨酸棒桿菌均為公認安全(GRAS)的革蘭氏陽性菌。由于其生物安全性，能夠產生多種有價值的代謝產物以及易于基因改造等特征，它們是極其重要的工業微生物生產菌株。目前，研究人員已經對這些菌株蛋白表達的各個階段采取一系列優化措施來提升異源蛋白的表達效率，包括啟動子優化，信號肽篩選，蛋白酶敲除等。

原核生物mRNA的5’非翻譯區(5’-UTR)通常包含核糖體綁定位點和其它可能存在的翻譯增強序列，是決定mRNA翻譯效率的關鍵性因素，同時可以保護mRNA的5’端不受RNA酶的攻擊，從而增強mRNA的穩定性。原核生物的核糖體30S小亞基通過mRNA上的SD序列與mRNA分子相結合，使下游的起始密碼子定位在核糖體的P點上，從而確定翻譯起始的第一個起始密碼子。因此，mRNA 5’-非翻譯區(UTR)的SD序列強度以及SD序列到起始密碼子的距離對于翻譯起始起著至關重要的作用。在原核生物中，通常認為基因由SD序列和起始密碼子共同確定唯一的翻譯起始位點。目前尚未發現在啟動子區域構建多拷貝RBS序列可以提高外源蛋白表達量的報道。

在之前的研究中，申請人公開了《一種基于核糖體結合位點改造的啟動子優化方法》以及SCI文章“Facilitating Protein Expression with Portable 5’-UTR SecondaryStructure in Bacillus licheniformis”，對芽孢桿菌中廣泛使用的P43啟動子進行改造，在5’-UTR區構建了一個莖環結構，使得核糖體結合位點(RBS)處于暴露狀態，這樣的結構有效提高了多個蛋白的表達量。在提供本發明技術方案之前，申請人嘗試將上述兩個公開文件中提供的單拷貝的序列，進行多拷貝串聯，發現串聯序列可以進一步提高蛋白的表達量，但提高幅度并不顯著。因此，針對上述問題，申請人對于如何提高蛋白表達量進行了進一步的探索。

發明內容

本發明的目的在于提供了用于增加革蘭氏陽性菌翻譯起始位點的序列，所述的序列為SEQ ID NO.1所示。

本發明的的另一個目的在于提供了用于增加革蘭氏陽性菌翻譯起始位點的序列在提高外源蛋白在革蘭氏陽性菌表達效率中的應用。

為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：

用于增加革蘭氏陽性菌翻譯起始位點的序列，所述的序列為SEQ ID NO.1所示用于增加革蘭氏陽性菌翻譯起始位點的序列在提高外源蛋白在革蘭氏陽性菌表達效率中的應用，所述是應用過程包括將N個SEQ ID NO.1所示的串聯后連接在外源蛋白翻譯的起始密碼子前端；所述的N為1-6之間的自然數。

以上所述的應用中，優選的，所述的革蘭氏陽性菌為：用于表達外源蛋白的枯草芽孢桿菌、地衣芽胞桿菌或谷氨酸棒狀桿菌。

以上所述的應用中，優選的，所述的地衣芽胞桿菌為地衣芽胞桿菌DW2、枯草芽胞桿菌為枯草芽胞桿菌168、谷氨酸棒狀桿菌為谷氨酸棒狀桿菌13032。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：