[發明專利]一種禾谷鐮孢分生孢子快速形成方法

有效

• 申請號: 202110390506.8
• 申請日: 2021-04-12
• 公開（公告）號: CN113061565B
• 公開（公告）日: 2023-03-24
• 發明（設計）人: 李永剛;孫磊;王爽;張雪;劉金鑫
• 申請（專利權）人: 東北農業大學;黑龍江省農業科學院土壤肥料與環境資源研究所
• 主分類號: C12N3/00
• 分類號: C12N3/00;C12R1/77
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 王敏

本發明公開了一種禾谷鐮孢分生孢子快速形成方法，屬于微生物技術領域、本發明公開的一種禾谷鐮孢分生孢子快速形成方法，所用培養基為濃度0.9％?1.5％的鹽水；培養溫度28?30℃；培養時間96h?120h；初始pH為8?10；光照，可見光；振動速度150?180rpm。本發明方法快速、簡單、經濟并且產孢速度快，為生產大量分生孢子提供了系統的、易于使用的孢子形成技術，用于禾谷鐮孢的各種理論研究、致病力測定及田間不同作物品種抗源篩選和鑒定工作。

技術領域

本發明涉及微生物技術領域技術領域，更具體的說是涉及一種禾谷鐮孢分生孢子快速形成方法。

背景技術

鐮孢菌是全世界重要的真菌病原體，可引起根，莖和葉病害。迄今為止，至少有15種鐮孢菌引起玉米穗腐爛、莖稈腐爛、鞘腐爛、幼苗枯萎和種子腐爛。其中，由禾谷鐮孢引起的病害尤為突出，莖腐爛(FSR)和穗腐爛(FER)是最普遍和破壞性病害之一，導致玉米減產，FSR和FER抗性品種的開發和種植是減少這些病害造成的損失的最經濟，最有效的策略。但在正常條件下，絕大多數禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)在不易產生分生孢子，沒有分生孢子，很難通過形態特征鑒定鐮孢菌，分離單個分生孢子以進行遺傳多樣性分析，大規模致病性測試或使用定量接種篩選抗性植物基因型。因此，分生孢子的大量生產對于禾谷鐮孢的研究非常重要。

目前，實驗室條件下禾谷鐮孢的產孢主要有兩種方法:固體平板培養和液體培養。已有的固體培養法主要是康乃馨葉片培養基，可以獲得少量分生孢子用于禾谷鐮孢的鑒定和單孢子分離等研究，但無法獲得大量分生孢子用于接種試驗，如菌株致病力測定及田間不同作物品種抗源篩選和鑒定工作；另一種就是液體培養法，報道較多的是綠豆液體培養基(MB)，需將綠豆在水中煮沸5-30min，用粗紗布過濾，濾液滅菌后作為培養基，培養14天可以獲得比固體平板培養多很多的分生孢子，用于致病力測定及田間不同作物品種抗源篩選和鑒定工作，但這種方法操作復雜，耗時長，成本高，產量也并不突出。

因此，提供一種禾谷鐮孢分生孢子快速形成方法是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種禾谷鐮孢分生孢子快速形成方法，該方法簡單、快速、經濟且產孢速度快。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種禾谷鐮孢分生孢子快速形成方法，具體步驟如下：

(1)液體培養基質的制備：用自來水配制濃度為0.9％-1.5％的鹽水，pH值調整為8-10；分裝，每100ml三角瓶裝液量為15ml，121℃滅菌30min，冷卻后備用；

(2)禾谷鐮孢的擴繁：將禾谷鐮孢轉移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基上培養，備用；

(3)禾谷鐮孢產孢的培養：挑取7-8個步驟(2)擴繁的均勻布滿菌絲的禾谷鐮孢的菌蝶(直徑0.7cm)轉移到步驟(1)滅菌后的三角瓶中培養，培養溫度28-30℃；培養時間96h-120h；初始pH為8-10；光照，可見光150-200lux；振動速度150-180rpm；

(4)禾谷鐮孢分生孢子懸浮液的獲得及計數：培養96h-120h后，用雙層紗布過濾，獲得分生孢子懸浮液，計數。

優選地，步驟(1)所述鹽水的濃度為0.9％。

進一步，步驟(2)所述培養條件為26-28℃黑暗培養8-10天。

進一步，步驟(4)所述計數方法為：取5μl分生孢子懸浮液在玻璃載玻片上涂一條線(約2mm寬)，在光學顯微鏡下計數，具體方法為：從玻璃載玻片一端開始移動計數，統計5μl分生孢子懸浮液中的孢子數；分生孢子懸浮液的濃度(分生孢子個數/ml)為：5μl分生孢子懸浮液中的孢子數/5×10³。