[發(fā)明專利]一種胃蛋白酶原Ⅱ重組蛋白及其單克隆抗體和制備方法及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110390444.0
• 申請(qǐng)日: 2021-04-12
• 公開（公告）號(hào): CN113046324A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黎榕萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 黎榕萍
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N9/64;C12N15/85;C07K16/40;G01N33/573
• 代理公司: 廣州京諾知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44407
• 代理人: 劉菊欣

本發(fā)明公開了一種CHO?K1細(xì)胞株，所述的CHO?K1細(xì)胞株含有能高效分泌表達(dá)PGⅡ重組蛋白的基因。本發(fā)明還公開了一種制備所述的CHO?K1細(xì)胞株的方法，所述方法包括以下步驟：1)將SEQ ID NO.1所示的基因序列克隆到真核表達(dá)載體中，以得到含有PGⅡ重組蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒；2)再將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO?K1細(xì)胞中，以得到CHO?K1細(xì)胞株；3)通過培養(yǎng)、篩選、馴化步驟2)中所述CHO?K1細(xì)胞株，以得到高效分泌表達(dá)PGⅡ重組蛋白的細(xì)胞株。本發(fā)明還公開了抗PGⅡ單克隆抗體，所述的單克隆抗體1結(jié)合的抗原表位位于胃蛋白酶原Ⅱ的aa78?aa90；所述的單克隆抗體2結(jié)合的抗原表位位于胃蛋白酶原Ⅱ的aa280?aa291。本發(fā)明的蛋白表達(dá)量高，質(zhì)量好，成本低；單克隆抗體能配對(duì)用于PGⅡ蛋白的檢測(cè)，特異性好、靈敏度高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種一種胃蛋白酶原Ⅱ重組蛋白及其單克隆抗體和制備方法。

背景技術(shù)

胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)是一種具有消化功能的內(nèi)切蛋白酶，是由375個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，屬于天冬氨酸蛋白家族。人胃蛋白酶原可根據(jù)在瓊脂凝膠電泳下的遷移率由快至慢分為pgl-pg7七種同工酶原，其中pgl-pg5有共同的免疫原性，也叫PG I；pg6到pg7遷移率較慢，也叫PG II。在組織體內(nèi)，PG I和PG II的細(xì)胞來源和組織分布各不相同。有研究表明PG I水平降低是胃病發(fā)生與發(fā)展的可靠標(biāo)志。國外也有人把低水平血清PG看作是胃病發(fā)生與發(fā)展的標(biāo)志，其通過流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，血清PG在胃粘膜萎縮范圍較廣，尤其是累及胃體時(shí)才有較明顯的下降。因此，檢測(cè)PG I和PG II在臨床上面具有重要的指導(dǎo)意義。

目前，市面上有多種用于PG II檢測(cè)的診斷試劑，方法學(xué)主要集中于免疫學(xué)診斷，具體為膠體金、化學(xué)發(fā)光、生化比濁法。使用這些方法的前提是有PG II蛋白以及適配的抗體。目前，PG II蛋白的來源主要有2種方式，一是從人血清中純化PG II蛋白，二是基因重組的方法體外表達(dá)PG II蛋白。因第一種方法費(fèi)事費(fèi)力，故成本相對(duì)較高，而第二種方法又要考慮合適的表達(dá)體系，以使表達(dá)的蛋白更接近于人體內(nèi)的PG II蛋白。針對(duì)PG II蛋白的檢測(cè)，使用單克隆抗體的特異性和靈敏度都較多抗更好，因此，篩選合適的單克隆抗體對(duì)PGII蛋白的診斷檢測(cè)起著重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提出了一種PG II重組蛋以及相關(guān)的單克隆抗體和制備方法及應(yīng)用。

因此，本發(fā)明一方面提供了一種CHO-K1細(xì)胞株，所述的CHO-K1細(xì)胞株含有能高效分泌表達(dá)胃蛋白酶原Ⅱ重組蛋白的基因。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的的胃蛋白酶原Ⅱ重組蛋白的基因是經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的核苷酸序列。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的密碼子優(yōu)化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

另一方面，本發(fā)明還提供了一種所述的CHO-K1細(xì)胞株的方法，所述方法包括以下步驟：1)將SEQ ID NO.1所示的基因序列克隆到真核表達(dá)載體中，以得到含有胃蛋白酶原Ⅱ重組蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒；2)再將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO-K1細(xì)胞中，以得到CHO-K1細(xì)胞株；3)通過培養(yǎng)、篩選、馴化步驟2)中所述CHO-K1細(xì)胞株，以得到高效分泌表達(dá)胃蛋白酶原Ⅱ重組蛋白的細(xì)胞株。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的真核表達(dá)載體為pEE12.4。

再一方面，本發(fā)明還提供了一種抗胃蛋白酶原Ⅱ單克隆抗體，所述的抗胃蛋白酶原Ⅱ單克隆抗體是使用權(quán)利要求1所述的CHO-K1細(xì)胞株表達(dá)的胃蛋白酶原Ⅱ重組蛋白制備的，所述的單克隆抗體1結(jié)合的抗原表位位于胃蛋白酶原Ⅱ的aa78-aa90；所述的aa78-aa90的氨基酸序列為SerIleGlyThrProProGlnAsnPheLeuValLeuPhe；所述的單克隆抗體2結(jié)合的抗原表位位于胃蛋白酶原Ⅱ的aa280-aa291；所述的aa280-aa291的氨基酸序列為SerLeuLeuThrValProGlnGlnTyrMetSerAla。