[發明專利]一種皮膚疾病基因SNP位點分型優化的方法

在審

• 申請號: 202110387831.9
• 申請日: 2021-04-09
• 公開（公告）號: CN113549684A
• 公開（公告）日: 2021-10-26
• 發明（設計）人: 黃宇東;汪淑基;陳震球;鐘楚倩;米丁丹;方浜杏
• 申請（專利權）人: 廣東瑞昊生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 李枝玲

本發明公開了一種皮膚疾病基因SNP位點分型優化的方法，包括以下步驟：1)提取DNA；2)對DNA進行PCR擴增；3)純化PCR擴增產物；4)對純化后的PCR擴增產物進行延伸；5)純化延伸產物；6)上測序儀；7)分析延伸產物的熒光標記和長度信息。本發明基于SNaPshot技術，針對不同SNP位點設計不同長度的和PCR擴增引物和延伸引物來做到多個SNP在一個反應體系中進行分型，可在16個位點同時分型通量。由于此方法為四色熒光標記，所以可以針對各種SNP類型進行分類，同時還可以對插入、缺失進行分析。分析得到皮膚疾病患者的基因分型后，有利于醫生的對癥下藥。

技術領域

本發明涉及基因識別技術領域，具體涉及一種皮膚疾病基因SNP位點分型優化的方法。

背景技術

皮膚病(dermatosis)是發生在皮膚和皮膚附屬器官疾病的總稱。皮膚是人體最大的器官，皮膚病的種類不但繁多，多種內臟發生的疾病也可以在皮膚上有表現。引起皮膚病的原因很多，比如感染因素引起的皮膚病，如麻風、疥瘡、真菌病、皮膚細菌感染等常常有一定的傳染性，不但影響身體健康，而且引起恐慌與社會歧視，但是隨著人們生活水平的提高和科學技術進步，麻風等傳染病在全世界已經得到明顯控制。其他引起皮膚病的內外在因素，如機械性、物理性、化學性、生物性、內分泌性、免疫性等，目前越來越受到人們的重視。

皮膚病患者包含多種基因分型，不同基因分型對于相關藥物的敏感性也不同。因此，在用藥前需要了解患者的基因分型，才能利于醫師對癥下藥。

單核苷酸多態性(SNP)標記分型的手段既有傳統的手段如SSCP(single str andconformation polymorphism)和CAPs(Cleavage Amplification Polymorphisms)等，也有現在較快速的手段如MassARRAY質譜和TaqMan探針方法等，還有基于芯片的檢測手段如DNA芯片技術已經開發出來并迅速被應用和趨于成熟。使用高密度的DNA芯片或微列陣可以同時對上萬個SNP的分型。目前SNP已經廣泛地應用于關聯分析，基因精細定位和分子標記輔助育種過程中。但是上述方法都存在一定的缺點：SSCP手段只能用非變性膠，實驗條件苛刻，需要常溫條件，一般實驗室難以達到；CAPs手段實驗過程繁瑣，一個實驗程序需要耗費很長的時間；MassARRAY質譜和TaqMan探針方法及其他芯片方法費用相當高昂，一般實驗室難以承擔。

SNaPshot技術，是在一個含有測序酶，四種熒光標記的dDNTP，緊挨多態位點5'端的不同長度延伸引物和PCR產物模板的反應體系中，引物延伸一個堿基即終止，經測序儀跑膠后，根據峰的顏色可知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型，現有技術中的采用SNaPshot(小測序)技術針對SNP分型一般用于10～30個位點的分型，只有10個同時分型位點，且由于擴增片段長度和熒光染料種類的限制，在一個復合擴增體系中只可以同時擴增較少的SNaPshot基因座，一般為一種熒光物質標記一個基因座，一個擴增體系最多可同時復合4個SNaPshot基因座。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種皮膚疾病基因SNP位點分型優化的方法，適用于與人體免疫功能紊亂/免疫功能失調相關的皮膚疾病，利用SNaPshotSNP分型技術對16個SNP位點體系進行優化，針對中等通量(10～50位點)的SNP分型項目進行技術上的改進，將同時分型位點從10個提高到16個，大大提高了分型的通量的準確性，準確性能達99.99％。

本發明的目的之一采用如下技術方案實現：

一種皮膚疾病基因SNP位點分型優化的方法，包括以下步驟：

1)提取樣品中的基因組DNA，得到DNA提取液；