[發明專利]一種人的新型超潛能性干細胞體外分化為類卵母細胞的方法

在審

• 申請號: 202110387532.5
• 申請日: 2021-04-10
• 公開（公告）號: CN115197901A
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發明（設計）人: 楊楊;朱迪聰
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075;C12N5/073
• 代理公司: 南京普睿益思知識產權代理事務所(普通合伙) 32475
• 代理人: 馬曉武

本發明公開了一種人的新型超潛能性干細胞體外分化為類卵母細胞的方法，分化步驟包括如下：S1，獲得EPS：首先需要獲得人的EPS，當達到第二階段時PGC啟動減數分裂，然后使其發育為配子；S2，PGC的特化：在BMP4誘導分化條件下，采用相對應的細胞提取方法，EPS將逐漸分化并產生表達SOX17的細胞。本發明通過利用化學小分子組合獲得了一類具有胚胎、胚外組織雙向發育潛能的多潛能性干細胞，此種超潛能性干細胞與經典的人的多潛能干細胞以及多潛能性干細胞相比，具有多項優勢：1.各細胞系均質性好，本發明的超潛能性干細胞的培養條件適用于多株多潛能性干細胞的培養，且細胞的均質性很強，避免了由細胞異質性造成的分化進程受到干擾。

技術領域

本發明涉及細胞技術領域，尤其是一種人的新型超潛能性干細胞體外分化為類卵母細胞的方法。

背景技術

隨著社會經濟發展和生育觀念改變，婦女生育年齡不斷推遲，要求生育的高齡婦女越來越多，但隨著年齡增大，女性卵巢儲備功能下降，卵巢對促排卵藥物反應能力下降，有調查數據指出，非贈卵體外受精胚胎移植周期的成功分娩率隨著年齡的增加而下降，而獲得了贈卵的周期的成功分娩率則較為穩定，隨著年齡的增加而變化，即使是絕經的婦女，獲得年輕婦女的優質卵子仍然可能受孕，除了高齡婦女，卵巢功能不全的患者也同樣需要供卵，目前在育齡婦女中，卵巢功能不全的發病率約在3％左右，并且，這一發病率隨著近年來工作生活節奏的加快以及環境污染的加劇，呈現出逐年升高的趨勢。雖然卵巢功能不全的患者經過治療可出現間斷排卵，但僅5％-10％能自發排卵并成功受孕，相對而言，供卵治療是卵巢功能不全患者助孕的有效手段，給該類患者帶來了生育的希望，而干細胞則是一類具有自我更新和分化潛能兩種特性的細胞，近年來，生殖生物學家們不斷嘗試利用多潛能性干細胞體外分化為原始生殖細胞，希望能夠進而獲得成熟的配子，特別是類卵母細胞，從而為有需要的患者提供卵子。

現有的干細胞在培養和分化時效率很低，評價體系單一，存在較大爭議，這與經典的人的多潛性干細胞處于難以參與胚胎發育的晚期多潛能性狀態有關系，從而導致發育潛能變低，分化效率變低，不能夠起到為女性生殖過程中提供缺少的卵子的效果，應用時存在一定的局限性。

發明內容

本發明針對背景技術中的不足，提供了一種人的新型超潛能性干細胞體外分化為類卵母細胞的方法。

本發明為解決上述現象，采用以下技術方案，一種人的新型超潛能性干細胞體外分化為類卵母細胞的方法，分化方法包括如下：

S1，首先需要獲得人的EPS，當達到第二階段時PGC啟動減數分裂，然后使其發育為配子；

S2，在BMP4誘導分化條件下，采用相對應的細胞提取方法，EPS將逐漸分化并產生表達SOX17的細胞；

S3，從EPS中特化出的PGC，攜帶部分非生殖細胞脫離培養皿皿底，而懸浮于培養基中；

S4，收集脫離皿底的團塊，將這些團塊在卵泡成熟培養基中培養成原始卵泡；

S5，其中可繼續生長發育的卵泡，最終排出卵子，如此即可獲得類卵母細胞。

作為本發明的進一步優選方式，步驟S2中，在獲得PGC時，人的胚胎發育至第5-10周產生PGC，小鼠的PGC則產生于胚胎期10.5-13.5天，在體內，PGC經歷二個發育階段，第一階段：PGC在胚胎期外胚層內出現，聚集在泌尿生殖脊外側，該階段的PGC具有干細胞特性。

作為本發明的進一步優選方式，步驟S2中，在發育配子的過程中，在體外，多潛性干細胞-PGC和PGC-生殖細胞的轉變可作為兩個常見的階段。

作為本發明的進一步優選方式，步驟S2中，采用的細胞提取方法為單層貼壁的方法。

作為本發明的進一步優選方式，步驟S3中，在PGC遷移的過程中一共耗時16.5h，達到細胞上下層分化的效果。