[發明專利]一種檢測活的不可培養狀態金黃色葡萄球菌的方法

有效

• 申請號: 202110385799.0
• 申請日: 2021-04-11
• 公開（公告）號: CN112831582B
• 公開（公告）日: 2022-10-28
• 發明（設計）人: 李萌;趙鳳;閆海洋;孟玲玲;楊朔;盧元元
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/14;C12R1/445
• 代理公司: 長春市恒譽專利代理事務所(普通合伙) 22212
• 代理人: 梁紫鉞

1.一種檢測活的不可培養狀態金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于：以全局調控因子sarA作為依賴于mRNA的反轉錄PCR技術的靶基因來檢測活的不可培養狀態金黃色葡萄球菌，該方法不用于疾病的診斷和治療。

2.根據權利要求1所述的一種檢測活的不可培養狀態金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）取30 mL的待測菌液樣品，在4℃條件下以8000×g重復離心多次富集菌體，加入1mL的0.85% NaCl溶液重懸；

（2）分別取1.5 mL和1 mL的對數生長期金黃色葡萄球菌液和重懸的待測菌液樣品于4℃條件下，以13400×g離心2 min收集菌體；

（3）用RNase-Free ddH₂O洗滌2次，去除上清液；

（4）加入100 μL1 mg/mL的溶葡萄球菌酶于37℃恒溫水浴鍋中處理1 h；

（5）使用RNA提取試劑盒進行RNA的提取；

（6）使用超微量紫外可見分光光度計對RNA的提取樣品進行檢測，測定260 nm和280 nm吸收值；

（7）對提取好的RNA溶液進行反轉錄；

（8）對反轉錄的樣品進行處理，配制 PCR 反應液，引物序列見下表1；

表1 金黃色葡萄球菌sarA基因和內參gyrB引物序列

（9）通過Step One Plus Real-time PCR系統采用兩步法PCR的擴增標準程序進行擴增：第一步：預變性，95℃，30 s，重復1次；第二步：PCR反應，95℃，5 s，60℃，30 s，重復40次；

（10）以gyrB作為內參，用2^-△△CT法計算基因表達水平的倍數變化，待測菌液樣品中sarA的表達和對數生長期金黃色葡萄球菌液的相比沒有顯著性差異，從數據分析上看，P值＞0.05，證明待測菌液樣品中存在不可培養狀態金黃色葡萄球菌。

3.根據權利要求2所述的一種檢測活的不可培養狀態金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于：步驟（1）中，待測菌液樣品中可培養菌數為0，活菌總數不為0。

4.根據權利要求2所述的一種檢測活的不可培養狀態金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于：步驟（5）中，RNA的提取使用RNAprep Pure總RNA提取試劑盒并按照說明書進行，離心皆在25℃條件下操作。

5.根據權利要求2所述的一種檢測活的不可培養狀態金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于：步驟（7）中，反轉錄過程按照Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kitwith dsDNase試劑盒說明書進行，實驗全程在冰盒上進行操作。

6.根據權利要求2所述的一種檢測活的不可培養狀態金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于：步驟（8）中，使用 TB Green?Premix Ex Taq^TM II 試劑盒，對反轉錄的樣品進行處理，按下列的組份配制 PCR 反應液：TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2X）10 μL，PCR Forward Primer（10 μM）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μM）0.4 μL，ROXReference Dye（50X）0.4 μL，DNA 模板2 μL，滅菌水6.8 μL，總體積20 μL，步驟（9）中，通過Step One Plus Real-time PCR 系統采用兩步法 PCR 的擴增標準程序在 20 μL 的總反應體積下進行擴增。

7.根據權利要求2所述的一種檢測活的不可培養狀態金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于：步驟（8）中，引物序列還包括如下表2和表3：

表2金黃色葡萄球菌pbp1基因和ebpS基因序列

表3金黃色葡萄球菌生物被膜形成相關基因序列

步驟（10）中， pbp1、ebps、icaA、icaB、icaC、icaD、fnbA、fnbB、ebh和agrA的表達水平顯著低于對數生長期。