[發明專利]傳染性喉氣管炎病毒強毒株及其應用

有效

• 申請號: 202110385416.X
• 申請日: 2021-04-10
• 公開（公告）號: CN113122509B
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發明（設計）人: 侯博;王晨燕
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02;A01K67/027;A61K49/00;C12R1/93
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明涉及一株傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）的分離、鑒定、動物感染模型的建立，屬于微生物技術領域。通過對福建省某疑似ILTV感染的病雞進行ILTV分離、純化和鑒定后命名為ILTV WF03株，用其純培養物感染4周齡或8周齡的SPF雞具有較高的致病力。本發明中的傳染性喉氣管炎病毒強毒株，具有較強毒力，感染4周齡或8周齡SPF雞導致典型的ILTV感染臨床癥狀，發病率分別為95%和100%，死亡率分別為40%和27.3%。因此建立的動物感染模型可用作不同藥物或預防治療方法有效性評價或疫苗效力檢驗用強毒株。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一株傳染性喉氣管炎病毒的分離、鑒定、動物感染模型的建立。

背景技術

傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）屬于皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科傳染性喉氣管炎病毒屬，感染主要引起雞的死亡和/或產蛋下降，嚴重的感染往往表現為呼吸困難、喘氣、有血樣液體咳出，具有很高的致死性，而溫和型感染主要表現為黏液性氣管炎、鼻炎、結膜炎、不愿活動和低死亡率等多種形式，不論是嚴重感染還是溫和型感染均給生產帶來了嚴重的損失和威脅。

ILTV野毒株的毒力差異很大，有的毒株具有很高的發病率和致死率，屬于強毒株，而也有感染后癥狀輕微或不明顯的弱毒株，由于野毒株毒力差異大，建立穩定的可供疫苗效力檢驗用的動物感染模型十分困難。本發明涉及的一株ILTV強毒株WF03株具有很高的發病率，對4周齡和8周齡SPF雞的發病率分別為95%和100%，死亡率分別為40%和27.3%，且發病主要以咳血、死亡和呼吸困難為主要臨床癥狀，其評判指標易觀察，因此WF03株屬于強毒株，且可以用作疫苗效力評價用攻毒毒株。

發明內容

本發明的目的在于構建一株傳染性喉氣管炎病毒，以及病毒分離、鑒定、動物感染模型的建立，具體包括以下步驟：

一株傳染性喉氣管炎病毒株，所述毒株命名為ILTV WF03株，已于2021年2月4日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:V202117，中國典型培養物保藏中心地址為中國武漢，武漢大學。

上述毒株的構建方法包括以下步驟：

（1）取臨床疑似ILTV感染雞處死后，無菌采集氣管和喉頭組織，將采集的病料組織以1:5的比例加入PBS研磨后凍融3次，12000 r/min離心10 min后以0.45 μm濾膜過濾，將過濾液以尿囊膜途徑接種10日齡SPF雞胚后繼續孵化7 d，無菌收獲尿囊膜以1:5的比例（質量體積比g/mL）加入PBS研磨后凍融3次，離心取上清繼續以尿囊膜途徑接種10日齡SPF雞胚，再傳代2次后，觀察雞胚病變；發現盲傳3代后雞胚尿囊膜呈現出灰白色痘斑，疑似ILTV病毒感染，按照中華人民共和國農業行業標準NY/T 556-2002 雞傳染性喉氣管炎診斷技術經鑒定為ILTV病毒；

（2）將鑒定過的ILTV分離株采用有限稀釋法在10日齡雞胚中進行純化，將疑似ILTV病毒液按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀釋度接種10日齡SPF雞胚，每個稀釋度接種6枚，繼續孵化7日后，檢測尿囊膜，尿囊膜出現灰白色斑的為陽性，取最高稀釋度的陽性尿囊膜研磨后制備成病毒液，采用同樣方式繼續純化2次；將純化的ILTV分離株命名為ILTVWF03株。

利用上述毒株建立SPF雞人工感染模型的方法，其特征在于，包括以下步驟：利用ILTV WF03株對8周齡或4周齡的SPF雞進行氣管攻毒，攻毒后連續觀察臨床癥狀14天。

所述攻毒的劑量0.2 mL/羽，病毒含量為10^4.0 EID₅₀。

本發明的優點在于：