[發明專利]一種調控番茄耐旱性的轉錄因子SpbHLH89及其應用

有效

• 申請號: 202110384120.6
• 申請日: 2021-04-09
• 公開（公告）號: CN112876551B
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發明（設計）人: 王娟;郭斌;王柏柯;李寧;胡佳蕙;楊濤;余慶輝;周濤
• 申請（專利權）人: 新疆農業科學院園藝作物研究所
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/29;C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 烏魯木齊博亞思知識產權代理事務所(普通合伙) 65110
• 代理人: 王志剛

1.一種調控番茄耐旱性的轉錄因子SpbHLH89超表達載體的構建方法，其特征在于：所述轉錄因子SpbHLH89，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；轉錄因子SpbHLH89超表達載體的構建方法包括下述步驟：

步驟一：以潘那利番茄葉片cDNA為模板，用KOD酶進行PCR擴增獲得目的片段，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用回收試劑盒回收目的片段，用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切pSUP1300空載，回收線性化骨架載體并與目的片段進行同源重組構建超表達載體；

步驟二：利用熱激法轉化T5-Zero感受態細胞，對單克隆進行菌落PCR鑒定陽性克??；

步驟三：pSUP1300載體選擇性標記基因為卡那霉素，提取PCR陽性克隆質粒進行測序驗證，獲得SpbHLH89基因的重組表達載體為pSUP1300-SpbHLH89；

步驟四：將pSUP-SpbHLH89表達載體導入農桿菌中GV3101中，得到含有目的片段的超表達載體農桿菌；利用農桿菌侵染葉片；

步驟五：誘導愈傷組織，經卡那霉素抗性篩選，得到轉基因陽性植株；

步驟六：獲得陽性轉基因株系T0代后，提取基因組DNA，對超表達植株進行檢測；在插入位點的兩側設計引物對，對目的片段進行PCR擴增，純化PCR擴增產物后進行測序，根據測序結果篩選超表達株系，并利用T2代植株進行干旱表型觀察和檢測。

2.根據權利要求1所述的一種調控番茄耐旱性的轉錄因子SpbHLH89超表達載體的構建方法，其特征在于：所述步驟二中進行菌落PCR鑒定陽性克隆所用的引物序列，其中正向引物如SEQ ID NO：4所示，5’-GCTCTAGAATGGATCCTCATTCTACTATAATGAGTGC-3’，反向引物如SEQID NO：5所示：5’-GGGGTACCTGTTGTTCTTTCAAATCCACCA-3’。

3.根據權利要求1所述的一種調控番茄耐旱性的轉錄因子SpbHLH89超表達載體的構建方法，其特征在于：如步驟六中所述插入位點的兩側設計引物對，該引物對分別為：SpbHLH89-F：5’-GCTCTAGAATGGATCCTCAT TCTACTATAA TGAGTGC-3’，SEQ ID NO：6所示，Flag-R：5’-TTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’ SEQ ID NO：7所示。

4.一種調控番茄耐旱性的轉錄因子SpbHLH89的應用，其特征在于，SpbHLH89基因通過影響滲透調節物質、ROS系統及氧化酶，從而使番茄抗旱性增高；所述轉錄因子SpbHLH89，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。