[發(fā)明專利]一種RNA 4-巰基尿嘧啶特異標(biāo)記方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110383937.1
• 申請日: 2021-04-09
• 公開（公告）號: CN113293203B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙永席;陳鋒;蘇麗
• 申請（專利權(quán)）人: 西安交通大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 范巍

1.一種RNA 4-巰基尿嘧啶特異標(biāo)記方法，其特征在于，包括：

利用水合肼對RNA 4-巰基尿苷進(jìn)行加成消除反應(yīng)，產(chǎn)生類似胞嘧啶的結(jié)構(gòu)；

所述類似胞嘧啶的結(jié)構(gòu)在RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的過程中與鳥嘌呤配對；

通過核酸測序的手段識別T到C的突變位點(diǎn)，對4-巰基尿苷的位置進(jìn)行單堿基識別，實(shí)現(xiàn)RNA 4-巰基尿嘧啶特異標(biāo)記；

所述加成消除反應(yīng)的條件如下：

以水為溶劑，以DTT作為緩沖液，在50℃的條件下反應(yīng)1.5h。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA 4-巰基尿嘧啶特異標(biāo)記方法，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄具體操作如下：

將經(jīng)過加成消除反應(yīng)后的RNA分別采用逆轉(zhuǎn)錄酶ProtoScriptⅡ、SuperScriptⅡ和Bst3.0進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA 4-巰基尿嘧啶特異標(biāo)記方法，其特征在于，所述通過核酸測序的手段識別T到C的突變位點(diǎn)，具體操作如下：

通過測序來表征4-巰基尿苷位點(diǎn)，由原來的A:T配對變?yōu)镃:G配對，實(shí)現(xiàn)4-巰基尿苷位置的單堿基識別。

4.實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1~3中任意一項(xiàng)所述的RNA 4-巰基尿嘧啶特異標(biāo)記方法的產(chǎn)品，其特征在于，包括：

加成消除反應(yīng)模塊，用于利用水合肼對RNA 4-巰基尿苷進(jìn)行加成消除反應(yīng)，產(chǎn)生類似胞嘧啶的結(jié)構(gòu)；

逆轉(zhuǎn)錄模塊，用于將類似胞嘧啶的結(jié)構(gòu)在RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的過程中與鳥嘌呤進(jìn)行配對；

核酸測序模塊，用于通過核酸測序的手段識別T到C的突變位點(diǎn)，對4-巰基尿苷的位置進(jìn)行單堿基識別；

所述的產(chǎn)品包括試劑盒、檢測試劑包、藥品。

5.一種識別細(xì)菌中4-巰基尿嘧啶的修飾位置的方法，其特征在于，包括：

從細(xì)菌中提出total RNA；

將total RNA與水合肼進(jìn)行加成消除反應(yīng)，total RNA中的tRNAval上有4-巰基尿苷的修飾，使tRNAval上4-巰基尿苷結(jié)構(gòu)變?yōu)榘盏念愃莆铮玫絫RNAval；其中，所述加成消除反應(yīng)的條件如下：以水為溶劑，以DTT作為緩沖液，在50℃的條件下反應(yīng)1.5h；

用如SEQ.ID.NO.12所示的引物對tRNAval進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；

通過核酸測序的手段證實(shí)細(xì)菌中4-巰基尿嘧啶的修飾位置。

6.一種評估水合肼標(biāo)記對4-巰基尿苷的突變率的方法，其特征在于，包括：

從細(xì)菌中提出total RNA；

將total RNA與水合肼進(jìn)行加成消除反應(yīng)， total RNA中tRNAval上的4-巰基尿苷同時進(jìn)行了加成消除反應(yīng)，使tRNAval上4-巰基尿苷結(jié)構(gòu)變?yōu)榘盏念愃莆铮黄渲校黾映上磻?yīng)的條件如下：以水為溶劑，以DTT作為緩沖液，在50℃的條件下反應(yīng)1.5h；

通過如SEQ.ID.NO.13所示的引物將tRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物延伸，通過如SEQ.ID.NO.14和SEQ.ID.NO.15所示的引物將所得的延伸產(chǎn)物進(jìn)行PCR放大，得到PCR產(chǎn)物；

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆，用一代測序識別出細(xì)菌中4-巰基尿苷的位置，用亞克隆法評估水合肼標(biāo)記對4-巰基尿苷的突變率。

7.一種評估腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組動態(tài)的方法，其特征在于，包括：

采用4-巰基尿苷對待評估腫瘤細(xì)胞進(jìn)行不同時間狀態(tài)的代謝標(biāo)記；

提取待評估的腫瘤細(xì)胞的total RNA；

將total RNA與水合肼進(jìn)行加成消除反應(yīng)，反應(yīng)之后的total RNA進(jìn)行建庫和二代測序，通過二代測序識別4-巰基尿苷位置，判斷腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)；其中，所述加成消除反應(yīng)的條件如下：以水為溶劑，以DTT作為緩沖液，在50℃的條件下反應(yīng)1.5h。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的評估腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組動態(tài)的方法，其特征在于，同一種細(xì)胞中的同一種基因，隨著4-巰基尿苷的代謝標(biāo)記時間延長，4-巰基尿苷標(biāo)記的位置增多和其代謝標(biāo)記的位置發(fā)生改變。