[發(fā)明專利]抗CK8蛋白的單克隆抗體及其細(xì)胞株、制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110383269.2
• 申請(qǐng)日: 2021-04-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112940118B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣寧城;楊清海;陳惠玲;王小亞;傅椿輝;林婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司
• 主分類號(hào): C07K16/18
• 分類號(hào): C07K16/18;C12N15/13;C07K14/47;C12N5/20;G01N33/577;G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 福州市景弘專利代理事務(wù)所(普通合伙) 35219
• 代理人: 方圓;林祥翔

本發(fā)明涉及一種可以識(shí)別人白細(xì)胞分化抗原CK8的單克隆抗體，分泌細(xì)胞株、其制備方法以及其在免疫檢測(cè)中的用途。其中，技術(shù)方案選取CK8蛋白C末端的340位至365位氨基酸序列為抗原肽，抗原肽與KLH載體蛋白偶聯(lián)得到所述免疫原；所述抗原肽的氨基酸序列為SEQID1所示的氨基酸序列，對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選和亞克隆，獲得高效分泌抗CK8蛋白單克隆抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞株14C2,以及由該細(xì)胞株所分泌的抗CK8蛋白單克隆抗體。本方案得到的抗體具有高特異性、敏感性，可以特異性識(shí)別表達(dá)CK8蛋白的細(xì)胞，適用于免疫學(xué)檢測(cè)，特別是免疫組化檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，特別涉及一種抗CK8蛋白單克隆抗體及其細(xì)胞株、制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

細(xì)胞角蛋白8(Cytokeratin8，CK8)作為細(xì)胞骨架的重要結(jié)構(gòu)之一，定位于人染色體12q13，在單層上皮、管狀上皮及假?gòu)?fù)層上皮中表達(dá)。CK8/18是單層上皮細(xì)胞中的中間纖維的主要組成部分，主要以二聚體的形式存在；分布在胃腸道，肝臟，膜腺和乳腺等癌癥易發(fā)部位。CK8是在單層上皮組織中特異表達(dá)的，定位在細(xì)胞漿，由483個(gè)氨基酸組成。細(xì)胞角蛋白8有3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，包括一個(gè)位于中也的，保守的形成a螺旋的桿狀結(jié)構(gòu)域，和與之連接的NH2末端頭部結(jié)構(gòu)域和COOH末端尾部結(jié)構(gòu)域。其中桿狀結(jié)構(gòu)域由兩個(gè)螺旋組成，每個(gè)螺旋還可分為兩個(gè)亞區(qū)，桿狀結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞完整性的喪失和嚴(yán)重的病征。

細(xì)胞角蛋白在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性上是有作用的，也作用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞分化。送個(gè)基因的突變會(huì)導(dǎo)致隱源性肝硬化。CK8在不同來(lái)源的上皮腫瘤細(xì)胞中持續(xù)性表達(dá)，是其侵襲特性的標(biāo)志。有研究指出，通過(guò)培養(yǎng)敲除CK8后的小鼠肝臟細(xì)胞及大鼠的H4肝臟細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在纖維素上貼壁塊，運(yùn)動(dòng)慢，設(shè)說(shuō)明在發(fā)育和腫瘤發(fā)生過(guò)程中CK8發(fā)揮著重要作用，主要是通過(guò)調(diào)控上皮細(xì)胞的粘附和運(yùn)動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。研究人員在B6C3F1及C57B1/6J為背景的小鼠中發(fā)現(xiàn)，CK8/18陽(yáng)性與肝腫瘤的發(fā)育巧多樣性有著緊密的關(guān)聯(lián)。CK8和CK18組成的二聚體的結(jié)構(gòu)由CK8鱗酸化Ser73和Ser431決定，小鼠肝臟組織的致瘤性轉(zhuǎn)化會(huì)導(dǎo)致嗜堿染色陽(yáng)性，說(shuō)明CK8和CK18與誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的増殖密切相關(guān)。已有研究表明，細(xì)胞角蛋白CK8/18的過(guò)度表達(dá)可能推動(dòng)惡性轉(zhuǎn)化的癌前細(xì)胞GST-P陽(yáng)性灶大鼠肝癌形成過(guò)程。最近的研究表明CK8參與了一些肝臟疾病的發(fā)生。CK8基因敲除小鼠發(fā)展為巧出血，并更易患肝損傷。在慢性肝病中，CK8與疾病的嚴(yán)重程度和進(jìn)展有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明人提供了一種抗CK8單克隆抗體，由保藏號(hào)為CGMCC NO 20769的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。

進(jìn)一步地，所述單克隆抗體特異性識(shí)別CK8蛋白。

進(jìn)一步地，所述單克隆抗體特異性識(shí)別CK8蛋白中的SEQID1所示的氨基酸序列。

進(jìn)一步地，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的DNA序列為SEQ ID2所示的核苷酸序列，所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的DNA序列為SEQ ID3所示的核苷酸序列。

進(jìn)一步地，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID4所示的氨基酸序列；所述單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID5所示的氨基酸序列。

進(jìn)一步地，所述單克隆抗體為小鼠IgG3亞型單克隆抗體。

發(fā)明人還提供了一種抗CK8單克隆抗體免疫原的制備方法：選取CK8蛋白C末端的340位至365氨基酸序列為抗原肽，抗原肽與KLH載體蛋白偶聯(lián)得到所述免疫原；所述抗原肽的氨基酸序列為SEQID1所示的氨基酸序列。

發(fā)明人還提供了一株分泌抗CK8蛋白分子的雜交瘤細(xì)胞株，所述細(xì)胞株為小鼠雜交瘤細(xì)胞株14C2，所述細(xì)胞株已于2020年9月17日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO 20769，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。