[發(fā)明專利]一種外泌體活性制劑的制備方法及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110382445.0
• 申請日: 2021-04-09
• 公開（公告）號: CN112972497A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發(fā)明（設計）人: 董曉華;李心遠
• 申請（專利權）人: 上海市同仁醫(yī)院
• 主分類號: A61K35/30
• 分類號: A61K35/30;C12N5/0793;A61P25/00
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 梁天彥

本發(fā)明公開了一種促血腦屏障修復的外泌體活性制劑的制備方法及其應用。用來源于新出生小鼠大腦皮層神經(jīng)元原代細胞培養(yǎng)上清，通過超高速離心獲得。將小鼠大腦皮層組織經(jīng)胰酶消化后鋪板培養(yǎng)，收集大腦皮層神經(jīng)元培養(yǎng)上清，利用低溫離心機經(jīng)反復離心后，將離心得到的外泌體溶于PBS中。通過粒徑分析儀分析大腦皮層神經(jīng)元細胞分泌的外泌體濃度以及外泌體大小，將外泌體通過CCV注射到血腦屏障損傷的斑馬魚模型中，可通過促進血管新生方式有效修復血腦屏障損傷，降低頭部血細胞流出量。因此，本發(fā)明公開的新生小鼠大腦皮層神經(jīng)元原代細胞分泌外泌體可在促進血管新生、促進血腦屏障損傷修復，可用于制備促血腦屏障修復的藥物或試劑。

技術領域

本發(fā)明涉及外泌體活性制劑領域，特別是涉及一種促血腦屏障損傷修復的外泌體活性制劑制備方法及其應用。

背景技術

血腦屏障是中樞神經(jīng)系統(tǒng)特有的由血管內皮細胞、星形細胞、周細胞和臨近神經(jīng)元構成的一種獨特而完整的細胞網(wǎng)絡結構；其對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內環(huán)境穩(wěn)態(tài)、控制物質交換、調節(jié)細胞運輸方面至關重要。在臨床上，急性缺血性中風后，代謝紊亂和能量失衡在細胞水平上引起繼發(fā)性損傷，如炎癥反應、氧化應激反應等，導致神經(jīng)元，神經(jīng)膠質細胞和血管細胞的死亡。其中，血腦屏障損傷和功能障礙是腦卒中常見的病理特征。腦卒中缺血再灌注后，血液中的炎癥細胞通過受損的血腦屏障進入缺血區(qū)域，分泌大量炎癥因子，如NF-κB、白細胞介素等進一步介導缺血再灌注區(qū)域的損傷，導致缺血性卒中的高死亡率，嚴重影響卒中患者預后。目前，針對腦卒中采用溶栓治療、神經(jīng)保護治療、血管內治療等治療方式，但尚缺乏針對血腦屏障損傷修復的有效治療方式。

國家1類創(chuàng)新藥依達拉奉右莰醇注射用濃溶液具有保護血腦屏障作用，在減輕缺血再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護作用，但該類藥目前在中國使用率較低，且療效也不如預期。

因此，積極尋找新型、有效、無毒副作用的靶向保護血腦屏障修復手段對急性缺血性卒中的治療十分必要。

發(fā)明內容

針對上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種促血腦屏障損傷修復的外泌體活性制劑的制備方法，具體方案如下：

取新出生第0天的小鼠大腦皮層組織，經(jīng)0.05-0.5％胰酶消化后鋪板，培養(yǎng)后收集大腦皮層神經(jīng)元培養(yǎng)上清，利用低溫離心機首次離心5-30分鐘；之后取上清第二次離心，時間為20-50分鐘；再次取上清第三次離心10-80分鐘；繼續(xù)取上清第四次離心50-100分鐘；最后取沉淀PBS溶解后第五次離心50-100分鐘后棄上清，將離心得到的外泌體溶于PBS中，即可制得促血腦屏障損傷修復的外泌體活性制劑；

優(yōu)選地，所述的小鼠具體為C57BL/6小鼠；

優(yōu)選地，所述的胰酶濃度為0.25％；

優(yōu)選地，所述的收集大腦皮層神經(jīng)元的時間為第4天及第7天；

其中，所述的低溫離心機的離心溫度為4℃；

優(yōu)選地，所述的首次離心具體為320g離心10分鐘；

優(yōu)選地，所述的第二次離心具體為2000g離心15分鐘；

優(yōu)選地，所述的第三次離心具體為10,000g離心30分鐘；

優(yōu)選地，所述的第四次離心為100,000g離心70分鐘；

優(yōu)選地，所述的第五次離心為100,000g離心70分鐘；

本發(fā)明的第二個目的在于，提供了一種將外泌體活性制劑在制備促血腦屏障損傷修復的藥物方面的應用。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明中的促血腦屏障損傷修復的外泌體活性制劑具有無毒副作用、穩(wěn)定、易保存、可量產(chǎn)等顯著優(yōu)勢。

附圖說明