[發(fā)明專利]一種底物濃度控制型時(shí)間分辨均相化學(xué)發(fā)光生物檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110381937.8
• 申請(qǐng)日: 2021-04-09
• 公開（公告）號(hào): CN112904003A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳翊平;何慧禹;聶榮彬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569;G01N33/74;G01N33/535;G01N33/532;G01N33/53;G01N21/76;C12Q1/6818;C12Q1/10;C12Q1/06;C12R1/42
• 代理公司: 武漢智嘉聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 42231
• 代理人: 徐紹新

本發(fā)明公開了一種底物濃度控制型時(shí)間分辨均相化學(xué)發(fā)光生化分析方法，包括如下步驟：(1)將催化劑和發(fā)光底物分別標(biāo)記在生物識(shí)別分子上；(2)將催化劑標(biāo)記的生物識(shí)別分子溶液和發(fā)光底物標(biāo)記的生物識(shí)別分子溶液混合，然后加入待測(cè)物溶液，進(jìn)行生物識(shí)別反應(yīng)并生成復(fù)合物；(3)向反應(yīng)體系中加入觸發(fā)劑，通過(guò)讀取特異性閃光信號(hào)強(qiáng)度從而對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量分析。本發(fā)明通過(guò)控制發(fā)光底物的濃度實(shí)現(xiàn)了均相體系中特異性和非特異性發(fā)光信號(hào)的分離，從而減少了非特異信號(hào)的干擾，不需要洗滌步驟，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生化分析領(lǐng)域，涉及分析檢測(cè)方法，尤其是一種均相化學(xué)發(fā)光生物檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

生化分析技術(shù)在國(guó)民經(jīng)濟(jì)的各個(gè)部門如食品安全、疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。近年來(lái)，生化分析領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)是如何在實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測(cè)的同時(shí)簡(jiǎn)化測(cè)定過(guò)程，這對(duì)于提高檢測(cè)效率至關(guān)重要。

化學(xué)發(fā)光法具有較高的靈敏度和較寬的線性范圍，在分析測(cè)試領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。尤其是化學(xué)發(fā)光生物傳感器，兼具化學(xué)發(fā)光的高靈敏度和生物識(shí)別反應(yīng)的高特異性，適合復(fù)雜樣品中痕量目標(biāo)物的定量分析，相比于其它光學(xué)生物傳感器，其設(shè)備簡(jiǎn)單，無(wú)需激發(fā)光源、光譜儀等部件，有效降低了儀器的復(fù)雜性和成本。傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光生物傳感器通常是將生物識(shí)別分子修飾在固相載體(孔板、光纖、磁珠)表面，通過(guò)免疫反應(yīng)或DNA分子雜交實(shí)現(xiàn)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的特異性識(shí)別組分的結(jié)合，在定量之前通過(guò)反復(fù)洗滌以實(shí)現(xiàn)結(jié)合和游離的酶標(biāo)特異性識(shí)別組分的物理分離，之后引入化學(xué)發(fā)光底物，產(chǎn)生特異性信號(hào)。然而，上述過(guò)程需要多步洗滌，不僅增加了操作的復(fù)雜性，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且還容易造成累積誤差。

均相測(cè)定是一種無(wú)需進(jìn)行分離的分析方式，檢測(cè)信號(hào)的開啟或關(guān)閉由特異性識(shí)別結(jié)合反應(yīng)決定，反應(yīng)后直接進(jìn)行測(cè)定，整個(gè)過(guò)程無(wú)需洗滌等分離步驟。目前，針對(duì)基于熒光和化學(xué)發(fā)光的均相測(cè)定形式研究較多，如熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、熒光偏振、空間鄰近化學(xué)發(fā)光(SPARCL)等策略，其主要依賴特異性識(shí)別結(jié)合反應(yīng)導(dǎo)致兩種生物識(shí)別分子的距離拉近，從而使得偶聯(lián)在生物識(shí)別分子上的標(biāo)記物發(fā)生直接或間接的相互作用，包括共振能量轉(zhuǎn)移或自由基氧化還原反應(yīng)，導(dǎo)致信號(hào)的增強(qiáng)或猝滅。

申請(qǐng)人所在的院系前期研發(fā)了一種檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法(CN 102053162 A)，通過(guò)將魯米諾(luminol)標(biāo)記到牛血清白蛋白上，再與毒死蜱分子偶聯(lián)，得到毒死蜱化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，然后將其與毒死蜱抗體和待測(cè)物進(jìn)行免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，向反應(yīng)液中加入H₂O₂并進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)定，從而可根據(jù)化學(xué)發(fā)光信號(hào)得到待測(cè)物中毒死蜱的含量，其中，H₂O₂與魯米諾的反應(yīng)是在pH 9.6的碳酸鹽緩沖液中進(jìn)行，在堿性條件下，H₂O₂分解產(chǎn)生O₂，進(jìn)而氧化luminol產(chǎn)生熒光。該方法能在不進(jìn)行洗滌分離的均相條件下檢測(cè)毒死蜱，但是也存在以下缺點(diǎn)：(1)檢測(cè)準(zhǔn)確性低。溶液中未參與免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的標(biāo)記物在加入H₂O₂后也會(huì)產(chǎn)生非特異性檢測(cè)信號(hào)，從而對(duì)復(fù)合物的檢測(cè)信號(hào)產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不能真實(shí)反映待測(cè)物的含量。(2)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)是在堿性條件下進(jìn)行，反應(yīng)速率可控性差，穩(wěn)定性不佳；(3)沒有酶的信號(hào)放大作用，導(dǎo)致靈敏度低等問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問題，尤其是前期研發(fā)中所存在的缺陷，提出一種酶促均相化學(xué)發(fā)光生物檢測(cè)方法，該方法通過(guò)控制化學(xué)發(fā)光底物的濃度和反應(yīng)速度，從發(fā)光信號(hào)產(chǎn)生的時(shí)間區(qū)分特異性和非特異性檢測(cè)信號(hào)，從而避免非特異性信號(hào)的干擾，提高均相檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏性。

上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種均相化學(xué)發(fā)光生物檢測(cè)方法，該方法是基于底物濃度控制的時(shí)間分辨均相化學(xué)發(fā)光生物檢測(cè)方法，包括如下步驟：

(1)將催化劑和發(fā)光底物分別標(biāo)記在生物識(shí)別分子上；