[發明專利]念珠菌的引物探針組合及應用、PCR反應液、試劑盒和方法

在審

• 申請號: 202110381694.8
• 申請日: 2021-04-09
• 公開（公告）號: CN113046463A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 何志捷;李偉超;何銘輝;賴炳權;顏爾聰;林釗;張紀斌;黎新年
• 申請（專利權）人: 中山大學孫逸仙紀念醫院;廣州永諾醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州駿思知識產權代理有限公司 44425
• 代理人: 潘桂生

1.一種念珠菌的引物探針組合，其特征在于：

包括第一引物探針組合和第二引物探針組合；

所述第一引物探針組合包括針對白念珠菌的第一上游引物、第一下游引物和第一探針，以及針對光滑念珠菌的第二上游引物、第二下游引物和第二探針；第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述第二引物探針組合包括針對近平滑念珠菌的第三上游引物、第三下游引物和第三探針，以及針對熱帶念珠菌的第四上游引物、第四下游引物和第四探針；第三上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，第三下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；第四上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，第四下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

2.根據權利要求1所述的念珠菌的引物探針組合，其特征在于：

所述第一探針、第二探針、第三探針和第四探針的兩端均分別設置有熒光報告基團和熒光淬滅基團。

3.根據權利要求2所述的念珠菌的引物探針組合，其特征在于：

第一探針和第二探針的熒光報告基團不同，第三探針和第四探針的熒光報告基團不同。

4.根據權利要求1-3任一項所述的念珠菌的引物探針組合，其特征在于：

第一探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；第二探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；第三探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；第四探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

5.權利要求1-4任一項所述的念珠菌的引物探針組合在PCR擴增和念珠菌檢測領域的應用。

6.一種PCR反應液，其特征在于：

包括第一PCR反應液和第二PCR反應液；

所述第一PCR反應液包括PCR預混液、權利要求1-4任一項所述的針對白念珠菌的第一上游引物、第一下游引物和第一探針，以及權利要求1-4任一項所述的針對光滑念珠菌的第二上游引物、第二下游引物和第二探針；

所述第二PCR反應液包括PCR預混液、權利要求1-4任一項所述的針對近平滑念珠菌的第三上游引物、第三下游引物和第三探針，以及權利要求1-4任一項所述的針對熱帶念珠菌的第四上游引物、第四下游引物和第四探針；

將所述PCR反應液用于PCR擴增時，第一PCR反應液和第二PCR反應液分別使用。

7.根據權利要求5所述的PCR反應液，其特征在于：

所述第一上游引物、第一下游引物、第二上游引物、第二下游引物、第三上游引物、第三下游引物、第四上游引物和第四下游引物的濃度為18-22μm/L；所述第一探針、第二探針、第三探針和第四探針的的濃度為9-11μm/L。

8.一種試劑盒，其特征在于：

包括權利要求6-7任一項所述的PCR反應液。

9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于：

還包括DNA提取試劑。

10.一種定量檢測四種念珠菌的方法，其特征在于：

包括以下步驟：

S1：取權利要求6-7任一項所述的PCR反應液；從待測樣品中提取DNA；

S2：以S1中提取的DNA為DNA模板，將DNA加入第一PCR反應液中，配置得到第一PCR特異擴增反應體系；以S1提取的DNA為進行PCR擴增的DNA模板，將DNA加入第二PCR反應液中，配置得到第二PCR特異擴增反應體系；

S3：分別對第一PCR特異擴增反應體系和第二PCR特異擴增反應體系進行數字PCR擴增，得到第一擴增產物和第二擴增產物；

S4：分別檢測第一擴增產物和第二擴增產物的熒光信號，通過熒光信號得出念珠菌的種類和數量。