[發明專利]一種永生化人臍帶間充質干細胞系的構建方法

在審

• 申請號: 202110379616.4
• 申請日: 2021-04-08
• 公開（公告）號: CN112941034A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 崔恒宓;李洪強
• 申請（專利權）人: 江蘇易諾維生物醫學研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/90;C12N15/113
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種永生化人臍帶間充質干細胞系的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：

a、以AAVS1基因第一外顯子序列，通過網站設計并篩選特異性靶向SV40基因的gRNA，引導Cas9蛋白進行定點切割；

b、構建了含有SV40大T抗原的同源重組載體AAVS1-SV40-T-NEO；

c、篩選出陽性的hMSC-SV40細胞系；

d、用實時定量PCR及常規PCR技術在DNA、mRNA水平檢測了SV40大T抗原基因的明顯表達；

e、用Western blot從蛋白水平檢測了SV40大T抗原基因的表達；

f、用成骨試劑誘導hMSC-SV40細胞系；

g、用CCK8檢測永生化細胞的增殖情況。

2.根據權利要求1所述的永生化人臍帶間充質干細胞系的構建方法，其特征在于：所述步驟c的具體操作為：用AAVS1-SV40-T-NEO和AAVS1-Cas9-sgRNA共轉染到分離后第二代人臍帶間充質干細胞，在新霉素的篩選下，成功篩選出陽性的hMSC-SV40大T抗原細胞系，并連續50代而不衰老死亡。

3.根據權利要求1所述的永生化人臍帶間充質干細胞系的構建方法，其特征在于：AAVS1基因第一外顯子序列如SEQ ID No:1所示。

4.根據權利要求1所述的永生化人臍帶間充質干細胞系的構建方法，其特征在于：SV40基因序列如SEQ ID No:2所示。

5.根據權利要求1所述的永生化人臍帶間充質干細胞系的構建方法，其特征在于：gRNA基因序列如SEQ ID No:3所示。