[發(fā)明專利]一種從被感染細胞中分離完整細菌的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110379604.1 | 申請日： | 2021-04-08 |
| 公開（公告）號： | CN113088454A | 公開（公告）日： | 2021-07-09 |
| 發(fā)明（設計）人： | 宗冰冰;張焱焱;任明星;劉宇;付書林;葉純;吳仲元;邱銀生 | 申請（專利權(quán)）人： | 武漢輕工大學 |
| 主分類號： | C12N1/02 | 分類號： | C12N1/02;C12N15/10 |
| 代理公司： | 武漢領君知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 42248 | 代理人： | 汪俊鋒 |
| 地址： | 430023 湖北省*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 感染 細胞 分離 完整 細菌 方法 | ||
本發(fā)明公開了一種從被感染細胞中分離完整細菌的方法，屬于細菌與細胞互作并從中分離細菌的技術(shù)領域。本發(fā)明方法包括以下步驟：往被細菌感染的細胞中加入Triton x?100和/或SDS，在0?4℃下孵育30?120min，再于0?4℃下離心、洗滌收集菌體；或往被細菌感染的細胞中加入Triton x?100和/或SDS，在0?4℃下孵育5?15min后加入KCl，在0?4℃下孵育20?40min，再于0?4℃下離心、洗滌收集菌體。通過本發(fā)明方法20min就可以完全裂解細胞分離得到形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、活力不受影響的細菌，并能提取得到高質(zhì)量的RNA。本發(fā)明大大縮短了從被感染細胞中分離完整細菌的時間。
技術(shù)領域
本發(fā)明屬于細菌與細胞互作并從中分離細菌的技術(shù)領域，具體涉及一種從被感染真核細胞中快速分離活力強完整性好的細菌的方法。
背景技術(shù)
隨著我國飼料中全面禁止添加抗生素時代的到來，由細菌導致的腸道健康及腸道外組織器官感染問題，給養(yǎng)殖業(yè)造成的危害越來越嚴重，且嚴重威脅著公眾健康。因此，尋找并開發(fā)新的抗生素替代品，是達到預防和治療細菌感染的有效手段，這一手段在越來越多的科研人員中達到共識。目前開發(fā)抗生素替代品的途徑多種多樣，但很多開發(fā)思路是以細菌的致病機制為基礎，主要以細菌的重要代謝途徑、信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)、分泌系統(tǒng)或毒力因子為靶標篩選并設計相應的抑制物，這些抑制物可通過抑制細菌的生長或致病能力達到預防或治療細菌感染的目的。然而，在抗生素替代品開發(fā)過程中，可供選擇的靶標分子很少。雖然與細菌生長和致病相關的多種基因被發(fā)現(xiàn)，但以此為基礎開發(fā)的抗生素替代品，效果遠沒有達到抗生素預防和治療細菌感染的效果，并且越來越多的未知病原被發(fā)現(xiàn)。因此，鑒定和研究與細菌生長和致病相關的基因，是開發(fā)高效抗生素替代品的前提。由于細菌的基因組較大，因此細菌生長和致病的調(diào)控網(wǎng)絡很復雜，為了高效挖掘細菌的重要生長或致病因子，科研工作者往往將細菌從被感染宿主體內(nèi)分離純化，在體外完成對其生長和致病機制的研究。
為了在體外模擬細菌感染宿主的真實過程，科研工作者往往在體外選用細菌與細胞互作，通過細菌感染細胞后，篩選與細菌生長或致病相關的基因。隨著越來越多的細菌基因組被破譯，以細菌全基因組為基礎的高通量測序方法(RNA-seq、ChIP-seq、Genechip)成為了解細菌生長或致病的有效方法。通過細菌感染細胞等體外實驗是模擬細菌在宿主體內(nèi)基因表達譜的有效方法，進一步與未感染細胞的細菌基因表達譜比較，可以鑒定細菌在感染宿主過程中發(fā)揮重要功能的基因，是揭示細菌生長和致病機制的有效手段。然而，由于細胞的存在嚴重影響了對細菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察，并且很難獲取單純的細菌RNA，嚴重阻礙了高通量篩選方法的應用。因此，從被感染的細胞中分離純化完整的細菌，可以為后續(xù)細菌形態(tài)結(jié)構(gòu)和單純的細菌RNA提取奠定基礎。
利用現(xiàn)有技術(shù)方法從被感染細胞中分離的細菌數(shù)量少、形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整并且從分離細菌中提取的RNA經(jīng)常被細胞RNA污染，嚴重阻礙了對細菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究，由于細胞RNA的污染，限制了多種高通量篩選方法對細菌基因表達譜的分析。因此，研發(fā)從被感染細胞中分離純化完整細菌的方法意義重大。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)從被感染細胞中分離純化細菌的方法存在的分離時間長、細菌死亡量大的問題，提供一種從被感染細胞中分離完整細菌的方法。通過本發(fā)明方法可短時間分離到形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、活性強的細菌，并且所提細菌RNA純度和質(zhì)量高。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
一種從被感染細胞中分離完整細菌的方法，包括以下步驟：往被細菌感染的細胞中加入Triton x-100和/或SDS，在0-4℃下孵育30-120min，再于0-4℃下離心、洗滌收集菌體。
優(yōu)選的，所述的方法中，加入0.025％的Triton x-100或0.1％的SDS。
優(yōu)選的，所述的方法中，加入0.0025-0.0175％的Triton x-100和0.03-0.09％的SDS。
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