[發明專利]DNA片段靶向富集方法及其在基因組靶向測序中的應用

在審

• 申請號: 202110377037.6
• 申請日: 2021-04-08
• 公開（公告）號: CN113106144A
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 李杰群;司中洲;譚潔瓊
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅二醫院
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12N15/10
• 代理公司: 安化縣梅山專利事務所 43005
• 代理人: 李琦

1.一種DNA片段靶向富集方法，其特征在于，包括以下步驟：

根據靶標片段的DNA序列信息分析所述靶標片段上下游向導RNA，并合成所述向導RNA；

獲取樣本DNA；

通過cas9蛋白和所述向導RNA對所述樣本DNA做體外cas9酶切反應，以從所述樣本DNA上切割所述靶標片段；

對通過體外cas9酶切反應切割的所述樣本DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，切下與所述靶標片段條帶大小對應的膠塊；

回收所述膠塊中的DNA并進行測序。

2.如權利要求1所述的DNA片段靶向富集方法，其特征在于，所述獲取樣本DNA的步驟包括：

獲取樣本組織，加入DNA裂解液研磨后，加入蛋白酶K，密封并放入搖床，獲得細胞裂解液；

在所述細胞裂解液中加入Tris飽和酚搖勻后，離心，獲取第一上清液；

在所述第一上清液加入Tris飽和酚、氯仿和異戊醇的混合液搖勻后，離心，獲得第二上清液；

在所述第二上清液中加入氯仿和異戊醇的混合液后，離心，獲得第三上清液；

在所述第三上清液中加入乙醇后，離心，棄上清，加入TE緩沖液，獲得所述樣本DNA。

3.如權利要求2所述的DNA片段靶向富集方法，其特征在于，所述Tris飽和酚、氯仿和異戊醇的混合液中，Tris飽和酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1；

所述氯仿和異戊醇的混合液中，氯仿和異戊醇的體積比為24:1。

4.如權利要求2所述的DNA片段靶向富集方法，其特征在于，所述回收所述膠塊中的DNA并進行測序的步驟包括：

回收所述膠塊中的DNA，獲得富集DNA片段；

在所述富集DNA片段中加入人工合成DNA片段，進行測序，所述人工合成DNA片段中帶有尿嘧啶。

5.如權利要求4所述的DNA片段靶向富集方法，其特征在于，所述在所述富集DNA片段中加入人工合成DNA片段，進行測序的步驟包括：

對所述富集DNA片段進行超聲打斷處理后，加入磁珠試劑并回收，再加入人工合成DNA片段，進行文庫構建和測序。

6.如權利要求1所述的DNA片段靶向富集方法，其特征在于，所述DNA片段靶向富集方法還包括向導RNA及cas9蛋白切割效率的驗證方法：

根據位于所述靶標片段上下游兩端的所述向導RNA設計驗證引物；

通過所述驗證引物和所述樣本DNA進行擴增，獲得包括所述向導RNA的待驗證片段；

通過所述cas9蛋白和所述向導RNA對所述待驗證片段做體外cas9酶切反應，以切割所述待驗證片段，將經過切割的所述待驗證片段電泳與預設片段大小進行比較。

7.一種如前述的DNA片段靶向富集方法在基因組靶向測序，尤其是針對基因組結構變異，如拷貝數變異、微缺失微重復等的靶向測序中的應用。