[發明專利]草甘膦抗性基因GR79和GAT的表達載體及應用

在審

• 申請號: 202110376902.5
• 申請日: 2021-04-08
• 公開（公告）號: CN112852867A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 李圣彥;郎志宏;李香銀;林敏;陸偉;李鵬程;張明俊
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/54;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

本發明涉及草甘膦抗性基因GR79和GAT的表達載體及應用。本發明提供的對草甘膦具有高耐受性的GR79基因和GAT基因的密碼子優化并合成的新的DNA序列，以及利用雙基因構建的植物表達載體pCGG，研究結果證明，轉入了所述植物表達載體的轉基因玉米不同組織中GR79和GAT基因可以正常轉錄和翻譯，苗期葉片中GR79蛋白表達量為733.15?2203.99ng/g，GAT蛋白表達量為101.56?345.84ng/g，兩蛋白在玉米中具有高表達量。結果表明轉GR79和GAT兩個基因玉米對靶標除草劑草甘膦具有高抗性，本發明對于利用這兩個基因轉化植物協同表達培育高抗草甘膦植物及其應用具有重要意義。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別是涉及GR79和GAT兩個草甘膦抗性基因的表達載體以及在植物耐草甘膦中的組合應用。

背景技術

我國農田的主要雜草超過250種，分布面積達4000多萬公頃，其中1000多萬公頃農田受害嚴重。我國平均每年因草害造成作物減產約13％，直接經濟損失占農作物總產值的10％～20％，利用化學方法來控制雜草已成為現代農業不可缺少的一部分。

草甘膦是一種廣譜滅生性、內吸傳導型除草劑，憑借其廣譜高效、環境友好等優點，現已成為世界上應用最廣泛的農藥品種。莽草酸途徑是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途徑。在高等植物體內芳香族氨基酸中苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的生物合成過程中，5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)是關鍵性的酶之一。EPSPS在莽草酸代謝途徑中催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)與莽草酸-3-磷酸(S3P)縮合。草甘膦是PEP的競爭類似物，其作用機理就是通過與EPSPS和S3P形成穩定的復合體EPSPS-S3P-草甘膦，競爭性地抑制EPSPS的活性，阻斷了莽草酸-3-磷酸轉化為5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸，使芳香族氨基酸化合物的形成受阻，同時造成莽草酸大量積累，促使類黃酮以及酚類化合物等激素和關鍵性代謝物失調，打亂了生物正常氮代謝進而導致生物體的的死亡。

但由于除草劑的非選擇性特點使其在使用過程中不可避免的會對農作物的生長發育產生影響。20世紀80年代以來，隨著生物基因工程技術的迅猛發展以及對植物抗除草劑機理分子水平上的研究進展使得通過轉基因技術讓農作物獲得耐除草劑性狀成為可能。1983年第一個除草劑抗性煙草問世，標志著這一領域的研究從探索走向成功，至今已經有多種耐除草劑轉基因作物進行商業化種植，如玉米、大豆、棉花、油菜等，產生了巨大社會經濟效益并在提高耕地利用效率、提高人工效率方面產生了巨大推動作用。目前商業化的耐除草劑轉基因作物主要采用的有cp4-epsps、mepsps、pat等基因。

GR79和GAT基因是從草甘膦嚴重污染的土壤細菌宏基因組中分離并克隆。GR79基因編碼EPSPS酶，草甘膦不能阻斷GR79-EPSPS合酶催化PEP與S3P生成EPSP的反應，使植物芳香族氨基酸和其他化合物合成代謝繼續進行，使植物獲得抗除草劑能力，保護植物正常生長。GAT基因編碼草甘膦-N-乙酰轉移酶，草甘膦N-乙酰轉移酶為作物抗草甘膦提供了不同于GR79-EPSPS途徑的全新作用機制。在草甘膦-N-乙酰轉移酶的作用下，乙酰輔酶A作為乙酰基供體，草甘膦分子的次級胺則作為乙酰基的受體，使草甘膦乙酰化失去除草劑活性，使轉基因植物獲得抗除草劑能力，保護植物正常發育生長。

GR79和GAT基因是創制耐除草劑植物的候選基因，研究者將35S啟動子分別連接在GR79基因和GAT基因的前面構建了植物表達載體pGBIGRGAT轉化棉花，獲得轉基因棉花，在T1代檢測對草甘膦的耐受性，噴施草甘膦異丙胺鹽溶液稀釋至1/200(絕對濃度為0.205g/100ml草甘膦異丙胺鹽)，噴施量為30升/畝，存活率在84％以上(CN 103981199 B)，在轉基因棉花葉片中表現了低草甘膦殘留量(Liang et al.Co-expression of GR79 EPSPS andGAT yields herbicide resistant cotton with low glyphosate residues.PlantBiotechnology Journal,2017,15:1622–1629)。