[發明專利]檢測多子小瓜蟲的Taqman探針qPCR檢測引物組和應用

在審

• 申請號: 202110373822.4
• 申請日: 2021-04-07
• 公開（公告）號: CN115181803A
• 公開（公告）日: 2022-10-14
• 發明（設計）人: 張其中;郭書權;付耀武
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 崔紅麗

本發明公開一種檢測多子小瓜蟲的Taqman探針qPCR檢測引物組和應用，屬于寄生蟲檢測領域。本發明根據多子小瓜蟲的靶標分子組織蛋白酶L基因序列，設計一對特異引物和一條探針。該引物和探針對多子小瓜蟲親緣關系較近的四膜蟲、草履蟲以及養殖水體水樣和底泥均無擴增，特異性強；檢測靈敏度高，檢測下限為5.4拷貝/μL，約為1只多子小瓜蟲，重復性好(該技術的變異系數低于5％)；方法檢測方便，省去了常規PCR方法中的電泳步驟以及杜絕了傳統PCR的氣溶膠污染，大大節約時間和提高檢測準確性；可應用于水體環境中和魚體上的多子小瓜蟲檢測，為預防多子小瓜蟲病，提供技術支持。

技術領域

本發明屬于寄生蟲檢測領域，具體涉及一種檢測多子小瓜蟲的Taqman探針qPCR檢測引物組和應用。

背景技術

多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)是世界上淡水和咸淡水魚類的重要寄生纖毛蟲，主要寄生于魚類的鰓和皮膚，形成白點，又稱白點病，該病危害大，病魚死亡率高，造成嚴重經濟損失。因此，防治小瓜蟲病是水產養殖中的重要工作，而及時發現水體中存在多子小瓜蟲是防治小瓜蟲病的關鍵，這就需要檢測水體中多子小瓜蟲的檢測技術。目前，國內外檢測多子小瓜蟲的方法主要是顯微鏡檢查、常規PCR、熒光定量PCR，但是，這些現有檢測方法要么應用范圍受限，要么檢測靈敏低，無法滿足需求。Taqman探針熒光定量PCR技術特異性強、靈敏度高，更適合用于定量檢測。因此，尋找新的靶標分子建立一種重現性好、特異性強、靈敏度高的Taqman探針熒光定量PCR方法，檢測水體環境中和魚體上的多子小瓜蟲就十分必要。

發明內容

為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的目的在于提供一種組織蛋白酶L基因在制備檢測、鑒別或診斷多子小瓜蟲的試劑中的應用。

本發明的另一目的在于提供一種檢測多子小瓜蟲的Taqman探針qPCR檢測引物組。

本發明的另一目的在于提供一種檢測多子小瓜蟲的Taqman探針qPCR檢測試劑盒。

本發明的另一目的在于提供上述引物組或試劑盒的應用。

本發明的再一目的在于提供一種定量檢測樣品中多子小瓜蟲的方法。

本發明提供一種Taqman探針熒光定量PCR檢測多子小瓜蟲的試劑盒及檢測方法，特別提供一對針對多子小瓜蟲的特異性引物Cathepsin F和Cathepsin R以及一條特異性探針Cathepsin-Probe，使用該試劑盒和檢測方法可快速檢測水環境和魚體上的多子小瓜蟲。

本發明以組織蛋白酶L(Cathepsin L，CTSL)基因為新靶標分子建立了特異靈敏的Taqman探針實時熒光定量PCR技術，并組配了該技術配套使用的試劑盒。組織蛋白酶L基因在不同物種間的相似度低，與多子小瓜蟲相似度最高的嗜熱四膜蟲在51％的覆蓋率下也只有65.07％的相似度，但多子小瓜蟲之間的組織蛋白酶L基因相似度高達99.64％，這說明該基因具有種間變異大，種內保守的特點，適合用作檢測靶標。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

組織蛋白酶L基因作為分子靶點在制備檢測、鑒別或診斷多子小瓜蟲的試劑中的應用。

優選的，所述的組織蛋白酶L基因的GenBank：XM_004039979.1。

所述的組織蛋白酶L的GenBank：XP_004040027.1。

一種用于檢測多子小瓜蟲的試劑，包含能夠檢測多子小瓜蟲的組織蛋白酶L基因的引物；

具體的，以Taqman探針熒光定量PCR法為基礎，針對多子小瓜蟲的組織蛋白酶L基因，設計一對特異引物和Taqman探針，序列如下：

Cathepsin F：5’-CAGGAGTTGCTTTCTTTG-3’；