[發明專利]質粒載體及其在靶向豬COL1A1位點定點整合外源基因中的應用在審
| 申請號： | 202110371942.0 | 申請日： | 2021-04-07 |
| 公開（公告）號： | CN112852877A | 公開（公告）日： | 2021-05-28 |
| 發明（設計）人： | 潘登科;杜嘉祥;王永 | 申請（專利權）人： | 成都中科奧格生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/85 | 分類號： | C12N15/85;C12N15/113;C12N15/90;A01K67/027 |
| 代理公司： | 北京集佳知識產權代理有限公司 11227 | 代理人： | 溫可睿 |
| 地址： | 610041 四川省成都市中國(四川)自由貿*** | 國省代碼： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 質粒 載體 及其 靶向 col1a1 定點 整合 基因 中的 應用 | ||
1.質粒載體，其包括：COL1A1位點同源左臂，外源基因和COL1A1位點同源右臂；
所述同源左臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述同源右臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根據權利要求1所述的質粒載體，其特征在于，包括順序連接的：COL1A1位點同源左臂，豬ICAM2啟動子，外源基因、polyA-1和COL1A1位點同源右臂。
3.根據權利要求1或2所述的質粒載體，其特征在于，包括順序連接的：COL1A1位點同源左臂，豬ICAM2啟動子，外源基因、polyA-1、COL1A1位點同源右臂、PGK啟動子、HSV-TK和polyA-2。
4.根據權利要求1或2所述的質粒載體，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根據權利要求4所述的質粒載體，其特征在于，所述外源基因為TM基因，其構建方式利用Overlap PCR，與豬ICAM2啟動子和polyA-1無縫連接。
6.一種質粒載體組合，其特征在于，包括定點整合載體和敲除載體：
所述定點整合載體為權利要求1～5任一項所述的質粒載體；
所述敲除載體為含有sgRNA的pX458載體；所述sgRNA核苷酸序列為SEQ ID NO:4。
7.權利要求5所述的質粒載體組合，在靶向豬COL1A1位點定點整合外源基因中的應用。
8.靶向豬COL1A1位點定點整合外源基因的方法，其包括：
將權利要求6所述的敲除載體，和線性化的權利要求5所述定點整合載體，轉染豬體細胞，篩選獲得陽性克隆。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述豬體細胞為豬耳成纖維細胞。
10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，轉染豬耳成纖維細胞后，與卵母細胞融合，獲得獲得整合外源基因的豬。
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