[發(fā)明專利]雙殼類水產(chǎn)中石房蛤毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110371355.1
• 申請(qǐng)日: 2021-04-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112858536A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 岳亞軍;朱波;陳傳德;陳偉紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市羅湖區(qū)疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N33/68
• 代理公司: 廣州瑞之凡知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44514
• 代理人: 黃愛(ài)君

1.一種雙殼類水產(chǎn)中石房蛤毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)法，其特征在于：包括如下步驟：

1.1樣品的提取：將雙殼類水產(chǎn)樣品洗凈后取出貝肉，加入PBS溶液，勻漿，將勻漿液煮沸，冷卻至室溫后，超聲提取，離心，收集上清液，取沉淀再重復(fù)提取一遍，合并兩次上清液，離心，得到提取液；

1.2樣品的凈化：將所述上清液過(guò)超纖維濾紙后，取濾液過(guò)STX免疫親和柱，然后加入乙酸-甲醇溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并氮吹至干，用初始流動(dòng)相溶液溶解并定容，膜過(guò)濾，得到樣品檢測(cè)液；

1.3樣品的檢測(cè)：將所述樣品檢測(cè)液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，液相色譜的條件包括：色譜柱為TSK-GEL Amide-80，流動(dòng)相包括A組分和B組分，A為含甲酸銨的甲酸水溶液，B為含甲酸銨和甲酸的乙腈水溶液，采用梯度洗脫；串聯(lián)質(zhì)譜的條件包括：正電噴霧離子源，干燥氣溫度為350℃，霧化壓力為38psi，毛細(xì)管電壓為4000V，質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙殼類水產(chǎn)中石房蛤毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)法，其特征在于：所述A組分中，甲酸銨的濃度為2mmol/L，甲酸的濃度為50mmol/L；所述B組分中，甲酸銨的濃度為2mmol/L，甲酸的濃度為50mmol/L，乙腈的體積百分含量為95％；

所述梯度洗脫的程序包括：0min時(shí)，A組分20％、B組分80％；2min時(shí)，A組分20％、B組分80％；6min時(shí)，A組分60％、B組分40％；8min時(shí)，A組分60％、B組分40％；8.01min時(shí)，A組分20％、B組分80％；13min時(shí)，A組分20％、B組分80％，流速為0.4mL/min，百分含量分別為體積百分含量。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙殼類水產(chǎn)中石房蛤毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)法，其特征在于：所述STX免疫親和柱的制備方法包括如下步驟：稱取未活化的Sepharose 4B，懸浮于HCl溶液中，溶脹后用HCl溶液洗滌，得到Sepharose 4B濕膠；將Sepharose 4B濕膠分別用30％丙酮水溶液、60％丙酮水溶液洗滌后，加60％丙酮水溶液，邊攪拌邊加入含溴化氰的丙酮，然后再加入含三乙醇胺的丙酮水溶液，攪拌，抽濾；依次用60％丙酮水溶液、30％丙酮水溶液、超純水、PBS溶液洗滌，然后再加入PBS溶液，攪拌均勻，得到處理好的凝膠；取STX單克隆抗體溶液，加入含NaCl的NaHCO₃溶液，再與所述處理好的凝膠于帶塞的玻璃容器中在4℃振蕩過(guò)夜，然后洗滌去除未偶聯(lián)的凝集素，抽濾，得偶聯(lián)的STX-Sepharose 4B；用2～3倍凝膠體積的Tris-HCl緩沖液封閉Sepharose 4B上多余的活性基團(tuán)，4℃過(guò)夜，洗滌凝膠，得到STX免疫親和柱。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙殼類水產(chǎn)中石房蛤毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)法，其特征在于：所述PBS溶液的pH為6.5～6.9；所述煮沸的時(shí)間為5～10min；所述超聲提取的時(shí)間為10～15min；所述離心的轉(zhuǎn)速為8000～11000r/min，時(shí)間為10～15min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙殼類水產(chǎn)中石房蛤毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)法，其特征在于：所述乙酸-甲醇溶液中，乙酸的體積百分含量為1％。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雙殼類水產(chǎn)中石房蛤毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)法，其特征在于：所述三乙醇胺與溴化氰的摩爾比為1.4～1.6:1。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙殼類水產(chǎn)中石房蛤毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)法，其特征在于：所述膜的粒徑為0.22μm。