[發明專利]一種豬肺炎支原體抗體檢測方法及應用

在審

• 申請號: 202110368129.8
• 申請日: 2021-04-06
• 公開（公告）號: CN113092783A
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發明（設計）人: 胡星星;賈雙;馮小英;丁琳;林琴
• 申請（專利權）人: 中農華大（武漢）檢測科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;C12N15/70;C07K14/30
• 代理公司: 武漢智慧恒知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42232
• 代理人: 彭沖

本發明公開了一種豬肺炎支原體抗體檢測方法及應用，通過大腸桿菌表達的P36和P46蛋白與致敏紅細胞混合進行豬肺炎支原體抗體檢測。本發明特異性地選擇豬肺炎支原體特異性蛋白P36和P46，通過大腸桿菌表達、Ni柱純化，制備的間接血凝致敏抗原最大程度上與豬肺炎支原體抗體反應，極大增加了反應范圍和敏感性，避免了與其它支原體的交叉反應，大腸桿菌表達致敏蛋白抗原，大大縮短生長周期和降低生產成本；檢測試劑穩定性好、敏感性高，重復性好，對其他病原抗體無明顯交叉反應，而且操作簡便、快捷，可用于臨床樣品檢測、免疫水平監測和流行病學調查。

技術領域

本發明涉及一種動物傳染病檢測用方法，屬于獸用生物制品領域。

背景技術

豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是引起豬氣喘病的主要病原，該病在世界范圍內廣泛流行，我國地方豬種和雜交豬種尤為易感，幾乎普遍存在，造成了重大損失。豬群一旦感染Mhp，便難以清除，可繼發感染PRRSV、PCV2等，從而導致多種疫苗接種失敗。

目前，豬支原體肺炎檢測技術主要有分離培養技術、PCR技術和血清學檢測技術等。分離培養技術和PCR技術主要針對病原的檢測診斷，體現為Mhp的感染情況，由于豬肺炎支原體對營養要求苛刻，使得其體外分離培養難度很大；PCR技術需要一定的設備，對操作人員的要求高。血清學檢測技術不僅能反應出Mhp的流行感染情況，還可以反應豬群的免疫水平。間接血凝試驗(IHA)是血清學檢測中經典方法，經過不斷改進后，已廣泛用于檢測各種病原的血清抗體，與ELISA相比，間接血凝試驗操作過程簡便、節省時間，且不需要特殊儀器。以往研究，IHA檢測豬肺炎支原體血清抗體都是用的全菌蛋白致敏醛化紅細胞，由于和其它支原體交叉反應等影響，未能達到理想的效果。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術中缺少快速靈敏檢測豬支原體肺

炎血清抗體的方法的缺陷，提供一種豬肺炎支原體抗體檢測方法及應用。

為了解決上述技術問題，本發明提供了如下的技術方案：

本發明將大腸桿菌表達的P36和P46蛋白作為抗原致敏醛化綿羊紅細胞，

建立一種簡便、穩定、敏感性、病原特異性強的方法，用于豬支原體肺炎的臨床樣品檢測、免疫水平監測和流行病學調查。

本發明提供一種制備豬肺炎支原體P36、P46蛋白的方法，這種豬肺炎支原體抗原蛋白可克服現有技術的不足，僅與豬肺炎支原體抗體發生反應但不與其它支原體抗體發生交叉反應。

所述的豬肺炎支原體蛋白P36和P46按如下方法獲得：本專利涉及豬肺炎支原體(J株，NCBI登錄號：NC_007295.1)P36、P46蛋白在大腸桿菌中表達的方法。具體包括豬肺炎支原體2個抗原蛋白：豬肺炎支原體膜蛋白P36、P46的全部或者部分有效抗原序列進行表達的蛋白。利用本發明制備的P36、P46蛋白，建立豬肺炎支原體間接血凝檢測方法，用于豬支原體肺炎的臨床樣品檢測、免疫水平監測和流行病學調查。

本發明提供了一種豬支原體肺炎間接血凝檢測方法，制備該方法所用的混合抗原為豬肺炎支原體的P36和P46蛋白的組合物，來源于大腸桿菌表達，經Ni柱純化后使用。

進一步的，豬肺炎支原體P36和P46蛋白的濃度均為5～50μg/mL。再進一步的，豬肺炎支原體P36和P46蛋白等量混合，所述組合物的總蛋白濃度為10～100μg/mL。

大腸桿菌表達P36蛋白的引物P36-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，P36-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，大腸桿菌表達P46蛋白的引物P46-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；P46-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

大腸桿菌表達P36蛋白的氨基酸序列為：