[發明專利]一種利用海鹽滲透壓脅迫篩選高產Macrolactins海洋芽孢桿菌的方法

有效

• 申請號: 202110367896.7
• 申請日: 2021-04-06
• 公開（公告）號: CN112961817B
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 甘雨滿;高程海;唐振洲;劉鍇;黃炳耀;劉永宏
• 申請（專利權）人: 廣西中醫藥大學
• 主分類號: C12N1/36
• 分類號: C12N1/36;C12R1/07
• 代理公司: 天津創智睿誠知識產權代理有限公司 12251
• 代理人: 王海濱

本發明公開了一種利用海鹽滲透壓脅迫篩選高產Macrolactins海洋芽孢桿菌的方法，本發明以顯著抑制野生海洋芽孢桿菌生長的50g/L海鹽滲透壓為初始篩選壓力馴化目標菌株，經過多次傳代培養使菌株適應該濃度海鹽滲透壓脅迫之后，將海鹽濃度提高至60g/L開始新一輪馴化，以此類推。當海鹽濃度提高至Ng/L時菌株無法生長，終止馴化過程。取(N?10)g/L海鹽脅迫的馴化菌液涂布含(N?10)g/L海鹽的ISP2固體培養基，即可獲得高比例的高產Macrolactins突變菌株。本發明以適當濃度的海鹽滲透壓脅迫作為篩選壓力結合適應性馴化策略，高效選育高產Macrolactins海洋芽孢桿菌突變菌株，解決這類菌株在選育優良菌種資源的過程中缺乏高效篩選標記的困境。

技術領域

本發明屬于微生物育種技術領域，具體來說涉及一種利用海鹽滲透壓脅迫篩選高產Macrolactins海洋芽孢桿菌的方法。

背景技術

Macrolactins為24元大環內酯類化合物，主要來源于海生Bacillus sp.和Actinomadura sp.，包含超過32種單體化合物，表現抗病毒、抗腫瘤和抗病菌等多種生物抑制活性，是一類具有廣譜生物抑制活性的化合物，在疾病治療、農業病蟲害生物防治等領域具有廣闊的應用潛力。Borriss研究團隊通過分析Bacillus amyloliquefaciens FZB42基因組，首次確認了PKS I型基因簇參與Macrolactins的合成。整個基因簇大小約54kb，共由11個模塊組成，每個模塊至少包括酰基轉移酶、酮基合成酶和酰基載體蛋白三個元件。每個元件在Macrolactins碳骨架的合成過程中承擔著不同的生物功能，酰基轉移酶負責底物的激活和運轉；酮基合成酶負責延伸聚酮鏈；酰基載體蛋白負責將完成延伸二個碳原子的聚酮鏈運轉到下一模塊，具體合成過程與脂肪酸碳骨架的合成過程類似。

盡管Macrolactins生物合成過程基因簇已經被成功解析，但其合成的分子調控機理和關鍵基因至今仍沒有得到系統的解析，一定程度上限制了利用現代分子生物學技術來改善海洋芽孢桿菌的Macrolactins代謝性能。傳統微生物育種技術包括理化誘變、Genomeshuffling、適應性馴化等可在遺傳背景不清晰的條件下提升微生物代謝性能，但利用這類育種技術在選育優良Macrolactins代謝突變菌株時，仍需要面臨不少障礙，最大問題是至今尚無高效的篩選標記應用于篩選優良Macrolactins代謝突變菌株。Yi X等人利用常壓室溫等離子體誘變技術(Atmospheric Room Temperature Plasma，ARTP)處理海洋芽孢桿菌，提高其Macrolactins代謝性能(Yi X,Gan Y,Jiang L,et al.Rapid improvement in themacrolactins production ofBacillus sp.combining atmospheric room temperatureplasma with the specific growth rate index[J].Journal ofBioscience andBioengineering,2020,130(1).)。具體操作過程如下：利用ARTP誘變技術處理菌株后涂布平板，根據平板上單菌落形態差異挑選出具有特異性菌落形態的菌株，進一步比較這部分菌株的生長速率差異，篩選出生長較快的突變菌株，最后通過發酵結合HPLC檢測挑選出最佳突變菌株。雖然作者最終獲得一株Macrolactins產量提升約50％的突變菌株，但整個篩選過程較為繁瑣，可靠性不高，最終的篩選效率也僅為6.67％。簡單而言，利用該策略選育優良海洋芽孢桿菌主要包括三個篩選指標：菌落形態、生長和代謝，可見利用該策略完成微生物育種工作強度較大、效率低，且由于菌落形態不再發生變化的原因育種工作最終只能實現第一輪誘變，不利于菌株代謝性能的進一步提升。

綜上所述，對于遺傳背景不清晰的產Macrolactins海洋芽孢桿菌而言，傳統微生物育種策略是理想的手段，而無法確定有效的篩選標記一定程度上阻礙了該類菌種資源的育種進程。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種利用海鹽滲透壓脅迫篩選高產Macrolactins海洋芽孢桿菌的方法。