[發(fā)明專利]利用miR-212及其靶基因調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110363273.2
• 申請(qǐng)日: 2021-04-02
• 公開（公告）號(hào): CN113583964B
• 公開（公告）日: 2023-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張锫文;朱礪;張順華;沈林園;牛麗莉;趙葉;陳蕾;郭鑫宇;吳霜;李欣榮;肖茜;林許韜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/113
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)創(chuàng)理想知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11513
• 代理人: 張素妍

本發(fā)明提供了一種利用miR?212及其靶基因調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞的方法，屬于細(xì)胞工程和生物工程的技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明以miR?212為研究對(duì)象，首次實(shí)現(xiàn)利用miR?212在豬卵巢顆粒細(xì)胞增值方面的方法，該方法包括步驟：將miR?212轉(zhuǎn)染入卵巢顆粒細(xì)胞中。本發(fā)明提供了一種顯著的調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞的增值，本發(fā)明方法簡單、易于實(shí)施推廣。本發(fā)明的研究表明，通過對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染miR?212后顯著促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖能力，為后續(xù)卵泡發(fā)育相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞工程以及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用?miR-212及其靶基因調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

卵泡顆粒細(xì)胞是卵泡發(fā)育和維持正常功能的重要條件，對(duì)維持卵?巢繁殖功能發(fā)揮著極其重要的作用。有研究者發(fā)現(xiàn)，卵泡閉鎖退化的?過程是由卵泡中顆粒細(xì)胞的凋亡觸發(fā)的，顆粒細(xì)胞的凋亡最終會(huì)導(dǎo)致?卵泡的閉鎖。在卵泡顆粒細(xì)胞中可以分泌類固醇激素、促卵泡素和促?黃體素等激素，還可以產(chǎn)生一些細(xì)胞因子(孕酮、干細(xì)胞生長因子和?表皮生長因子等)，調(diào)控著卵泡和卵母細(xì)胞的生長發(fā)育。

在生豬生產(chǎn)中仔豬的出生率與生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益顯著正相關(guān)，如何?提高產(chǎn)子數(shù)在現(xiàn)代豬遺傳育種工作中都扮演至關(guān)重要的角色。目前對(duì)?于提高母豬產(chǎn)子數(shù)主要依賴遺傳輔助標(biāo)記選擇，對(duì)于標(biāo)志基因純合或?雜合個(gè)體的篩選以及與產(chǎn)子性能較好的豬種如太湖豬等雜交育種，除?此之外暫無極為顯著的提高方法。然而，母豬的產(chǎn)子數(shù)還與卵泡的發(fā)育相關(guān)，卵巢顆粒細(xì)胞直接影響卵泡的發(fā)育，因此探究影響卵巢顆粒?細(xì)胞增殖的條件在生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)于促進(jìn)卵泡發(fā)育、排卵具有重要意義。

miRNA是一類長度22nt左右的小分子絕大多數(shù)不具備編碼能力?的小分子RNA，主要依賴于2-8位的種子序列與編碼基因的3’端非?翻譯區(qū)相結(jié)合，從而沉默復(fù)合靶基因發(fā)揮生物學(xué)功能。大量研究表明miRNA在調(diào)控卵泡發(fā)育、閉鎖等生物過程中扮演重要角色，并且在?卵巢癌癥等相關(guān)領(lǐng)域也有大量報(bào)道。然而，如何利用miRNA調(diào)控卵?巢顆粒細(xì)胞的增值，目前仍待研究。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和需求，本發(fā)明的目的在于提供一種利用?miR-212及其靶基因調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的方案如下：

將miR-212轉(zhuǎn)染入卵巢顆粒細(xì)胞中。

作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，在進(jìn)行所述轉(zhuǎn)染前，還包括分離、?接種、傳代培養(yǎng)和收樣操作。

作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述巢顆粒細(xì)胞為豬卵巢顆粒細(xì)胞。

作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，進(jìn)行所述分離操作時(shí)，按照如下方?法進(jìn)行：

1)于母豬屠宰后取出卵巢，置于PBS中清洗后，將卵巢保存在?38攝氏度的生理鹽水中于1小時(shí)內(nèi)分離卵巢顆粒細(xì)胞；

2)將卵巢放到預(yù)熱好的37度生理鹽水中清洗干凈后，用手術(shù)刀?將卵巢表面每間隔1毫米均勻輕輕劃破，收集卵泡液，將吸取后的卵?泡液放入15ml離心管，1000rpm離心8分鐘，棄上清，用預(yù)熱的PBS?輕輕吹打均勻清洗離心重復(fù)兩次；

3)配制的卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液為20％FBS加DMEM以及1％的?抗生素。

作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，在進(jìn)行接種前，待卵巢顆粒細(xì)胞增?殖到85％后，棄掉原培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次后用巴氏吸管加入1ml?胰酶，放入37度細(xì)胞培養(yǎng)箱，放置2min后加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，?將細(xì)胞吹打下來，將懸液吸入15ml離心管；最終將細(xì)胞用培養(yǎng)液沖?勻接種到12孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。

作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天，將處于細(xì)胞接?種至12孔培養(yǎng)板中，當(dāng)增殖細(xì)胞密度達(dá)到35～45％時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48?小時(shí)候后收樣。