[發明專利]用于檢測高危型HPV病毒的試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202110362640.7
• 申請日: 2021-04-02
• 公開（公告）號: CN113063943A
• 公開（公告）日: 2021-07-02
• 發明（設計）人: 羅瑩;王清路;陳菊
• 申請（專利權）人: 淄博市中心醫院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543;G01N33/558;C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 淄博啟智達知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 37280
• 代理人: 任永哲

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種用于檢測高危型HPV病毒的試劑盒及檢測方法。用于檢測高危型HPV病毒的試劑盒是由恒溫擴增區、金標制備區和膠體金試紙條組成；恒溫擴增區是由第一試劑和第二試劑組成，第一試劑是由解旋酶、單鏈DNA結合蛋白、Klenow?I DNA聚合酶、四種dNTP混合物和buffer組成，第二試劑為HPV特異性擴增引物溶液；金標制備區包括膠體金標記的dCas9蛋白溶液和gRNA溶液；膠體金試紙條是由被襯底板、樣品墊、金標墊、基膜和吸水墊組成，被襯底板上從左到右依次設置有樣品墊、金標墊、基膜和吸水墊。本發明操作便捷并有效提高了檢測特異性及反應靈敏度。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種用于檢測高危型HPV病毒的試劑盒及檢測方法。

背景技術

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是球形DNA病毒，能引起人體皮膚黏膜的鱗狀上皮增殖。在世界范圍婦女中，宮頸癌(CC)及其癌前病變是列第三位的非常普遍的惡性疾病。最常見的宮頸癌發病因素為高危型HPV感染，其中HPV16、HPV18型與宮頸癌發病的關系最為密切。HPV16感染主要導致宮頸鱗癌，HPV18感染主要導致宮頸腺癌。我國宮頸癌新發病例約為6.2萬例，占全球新發病例的12％，死亡病例約3萬例，占全球死亡病例的11％。現已明確宮頸癌與高級別宮頸鱗狀上皮內病變(HSIL，包括CINⅡ/Ⅲ級)的發生、發展主要由高危型HPV持續感染所致。在發達國家由于宮頸癌篩查制度的建立與完善，子宮頸浸潤癌的發病率和死亡率已大幅度下降，但在廣大發展中國家，要在短期內進行大規模、覆蓋廣泛、高質量的宮頸癌普查存在較大困難。我國總體人群篩查率處于低水平，2010年全國城市平均子宮頸癌篩查率為29.1％，農村僅為16.9％。HPV DNA檢測多采用qPCR技術以提高HPV檢出率，但其檢測成本相對較高，有特殊檢測設備的要求，限制了其臨床應用。

核酸檢測技術近年來發展迅速，尤其是在分子診斷POCT領域。其中，熒光PCR(qPCR)特異性強、靈敏度高，可以定量對病原體進行檢測，但熱循環過程需要熱循環儀，熱循環儀體積大、價格高、耗時長，使其在基層的推廣和現場檢測受到了極大的限制。恒溫擴增技術不需要加熱循環，在恒定溫度下即可使新合成的DNA模板退火變性而引發進一步擴增反應，具備價格低廉、檢測快速等優勢，更適合于進行基層推廣和現場檢測。恒溫擴增技術中依賴解旋酶的恒溫基因擴增(Helicase-dependent amplification,HDA)是美國NewEngland Biolabs的研究人員模擬動物體內DNA的復制機制，發明的一種體外恒溫基因擴增技術，與其它恒溫擴增技術相比，引物設計簡單，操作便捷，不需要昂貴的PCR儀，更適合在基層實驗室推廣應用。

先前研究證實，CRISPR/Cas系統是近年來興起的一項靶向基因編輯工具，已廣泛用于動植物、細菌、真菌、寄生蟲等的靶向基因編輯。在眾多類型的CRISPR/Cas系統當中，CRISPR/dCas9系統已被證實可用于核酸檢測，具備靈敏高效、制備簡單、成本低廉等諸多優勢。但目前尚無將其應用于高危型HPV DNA檢測的相關報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于檢測高危型HPV病毒的試劑盒，靈敏性高、特異性強且價格低廉；本發明同時提供了檢測方法。

本發明所述的用于檢測高危型HPV病毒的試劑盒是由恒溫擴增區、金標制備區和膠體金試紙條組成；

恒溫擴增區是由第一試劑和第二試劑組成，第一試劑是由解旋酶、單鏈DNA結合蛋白、Klenow-I DNA聚合酶、四種dNTP混合物和buffer組成，第二試劑為HPV特異性擴增引物溶液；

金標制備區包括膠體金標記的dCas9蛋白溶液和gRNA溶液；

膠體金試紙條是由被襯底板、樣品墊、金標墊、基膜和吸水墊組成，被襯底板上從左到右依次設置有樣品墊、金標墊、基膜和吸水墊；