[發明專利]一種人參干細胞的分離培養方法

有效

• 申請號: 202110361871.6
• 申請日: 2021-04-02
• 公開（公告）號: CN113025552B
• 公開（公告）日: 2021-10-26
• 發明（設計）人: 高秀君;劉冰;張明臣;閆培生
• 申請（專利權）人: 山東安然納米實業發展有限公司
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;A01H4/00
• 代理公司: 北京元中知識產權代理有限責任公司 11223
• 代理人: 盧雪梅

1.一種人參干細胞的分離培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）采用一步法培養人參不定根，包括：將成熟人參清洗消毒，切片，接種到不定根誘導培養基中誘導出人參不定根；將獲得的人參不定根再次接種到不定根誘導培養基中繼代培養擴繁；然后將獲得的人參不定根剪切成段，接種到液體培養基中培養獲得不定根；

所述不定根誘導培養基包括1-6mg/L萘乙酸，0.1-0.6mg/L激動素，0.2-1mg/L赤霉素，0.075-1.5g/L檸檬酸，0.03-1g/L抗壞血酸，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝膠，1-4g/L B5培養基和1-2.4g/L WPM培養基；

（2）取人參不定根的根尖部分，解剖分離獲取干細胞區域；

（3）分離培養：將干細胞區域接種到干細胞誘導培養基中暗培養，獲得干細胞團；

所述干細胞誘導培養基包括2-4mg/L赤霉素，0.6-1mg/L激動素，2-4 mg/L吲哚乙酸，15-75mg/L抗壞血酸，50-150mg/L檸檬酸，20-60g/L 蔗糖，1-6g/L植物凝膠，1-2.4g/L 1/2MS培養基，1-2.5g/L B5培養基；

（4）繼代培養：挑取部分（3）獲得的干細胞團接種到干細胞繼代培養基中，暗培養；

所述干細胞繼代培養基包括2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激動素，20-60g/L 蔗糖，1-6g/L植物凝膠，1-2.4g/L 1/2MS培養基和0.6-1.4 g/L WPM培養基；

（5）液體培養：將（4）獲得的干細胞接種到干細胞液體培養基中，暗培養，獲得人參干細胞；

所述干細胞液體培養基包括2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激動素，20-60g/L 蔗糖，1-2.4g/L 1/2MS培養基和0.6-1.4 g/L WPM培養基。

2.根據權利要求1所述的一種人參干細胞的分離培養方法，其特征在于，干細胞誘導培養基包括3mg/L赤霉素，0.8mg/L激動素，2.5 mg/L吲哚乙酸，50mg/L抗壞血酸，100mg/L檸檬酸，40g/L 蔗糖，3g/L植物凝膠，1.8g/L 1/2MS培養基，1.5g/L B5培養基。

3.根據權利要求1所述的一種人參干細胞的分離培養方法，其特征在于，干細胞繼代培養基包括3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激動素，35g/L 蔗糖，3g/L植物凝膠，1.8g/L 1/2MS培養基和0.8 g/L WPM培養基。

4.根據權利要求1所述的一種人參干細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟（3）和（4）中，在20-25℃下黑暗培養，直至接種干細胞長出大量細胞團。

5.根據權利要求1所述的一種人參干細胞的分離培養方法，其特征在于，干細胞液體培養基包括3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激動素，35g/L 蔗糖，1.8g/L 1/2MS培養基和0.8 g/L WPM培養基。

6.根據權利要求1-5任意一項所述的一種人參干細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟（5）中，在20-25℃，100-150rpm下黑暗培養，3-5周傳代一次。

7.根據權利要求1-5任意一項所述的一種人參干細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟（2）中，取（1）中培養的人參不定根的根尖部分，在顯微鏡下觀察根尖部分，根據干細胞的特征確定干細胞區域，顯微操作以解剖刀切割獲得根尖干細胞區域。

8.根據權利要求1-5任意一項所述的一種人參干細胞的分離培養方法，其特征在于，所述人參選自野山參，移山參，林下參，園參。

9.根據權利要求8所述的一種人參干細胞的分離培養方法，其特征在于，所述人參為野山參。