[發明專利]抗石斑魚神經壞死病毒納米抗體的制備方法及應用

有效

• 申請號: 202110361829.4
• 申請日: 2021-04-02
• 公開（公告）號: CN113214387B
• 公開（公告）日: 2022-12-30
• 發明（設計）人: 鄧利;周培展;曾子誠;楊曉東
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/13;C12N15/10;C12N15/70;C12N15/66;C12P21/02;G01N33/569
• 代理公司: 深圳中一聯合知識產權代理有限公司 44414
• 代理人: 黃志云

本申請涉及抗體制備技術領域，提供了一種抗石斑魚神經壞死病毒納米抗體的制備方法，該制備方法包括將石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白免疫注射羊駝，通過分離其外周血淋巴細胞的RNA克隆出羊駝抗體VHH基因，進行克隆并構建了納米抗體免疫文庫。利用噬菌體展示技術對免疫文庫進行淘選，篩選出抗石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白的特異性納米抗體。該制備方法可以大量制備抗石斑魚神經壞死病毒納米抗體，且得到的抗體純度高，抗神經壞死病毒活性強，應用潛力大、前景好，有利于廣泛應用。

技術領域

本申請屬于抗體制備的技術領域，尤其涉及一種抗石斑魚神經壞死病毒納米抗體的制備方法及應用。

背景技術

魚類病毒性神經壞死病(viral nervous necrosis,VNN)，也稱為病毒性腦病和視網膜病(viral encephalopathy and retinopathy,VER),其病原為神經壞死病毒(Nervousnecrosis virus,NNV)。NNV屬于野田病毒科(nodaviridae)，β野田病毒屬(Betanodavirus)，是一種小型無囊膜病毒，衣殼由180個衣殼亞單位組成，其病毒粒子為二十面體對稱結構，直徑大約25-30nm。NNV基因組包括2條單鏈正義RNA，RNA1和RNA2。RNA1編碼依賴于RNA的RNA聚合酶，能復制病毒基因組，而RNA2則編碼病毒唯一的衣殼蛋白的前體。根據RNA2的核苷酸差異，可以將NNV分為四種基因型：赤點石斑魚神經壞死病毒(red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)、黃帶鲹神經壞死病毒(striped jacknervous necrosis virus,SJNNV)、條斑星鰈神經壞死病毒(barfin flounder nervousnecrosis virus,BFNNV)和紅鰭東方鲀神經壞死病毒(tiger puffer nervous necrosisvirus,TPNNV)。

VNN病害在世界各地被報道，嚴重危害了魚類養殖的發展，被世界動物衛生組織(Office International Des Epizooties,OIE)列為重要魚類病害。我國農業部發文，在2018年里有監測的魚類疫病中，病毒性神經壞死病陽性樣品檢出率最高。而我國NNV高發地區主要在海南、廣東、福建和臺灣地區，而大陸地區流行的NNV基因型是RGNNV，其主要爆發在石斑魚幼苗中，感染的石斑魚幼苗死亡率可以達到100％，嚴重危害著石斑魚養殖。我國沿海大規模網箱養殖的石斑魚，由于經常性受神經壞死病毒的感染，養殖產業損失巨大。至今尚無有效的特效抗NNV的藥物或生物制劑。雖然有多種抗NNV疫苗對魚體有一定的保護效果，但是在免疫系統還未完善發育的魚苗中發揮的作用比較有限。

病毒粒子衣殼對宿主細胞感染有重要作用，而NNV衣殼蛋白亞單位，其主要包含3個結構域，分別參與了組裝病毒粒子時募集RNA，包裝衣殼形成病毒粒子，病毒與宿主細胞表面相互作用。通過制備抗NNV衣殼蛋白的抗體可以為病毒感染機制和診斷防治提供參考。

目前，已有利用NNV衣殼蛋白制備抗NNV單克隆抗體，或是制備了抗NNV的特異性卵黃抗體，但是上述制備抗體的方法工藝復雜、無法制備大量抗體；且得到的抗體純度低、成本高、分子量大易降解失活等缺點，不利于使用。

發明內容

本申請的目的在于提供一種抗石斑魚神經壞死病毒納米抗體的制備方法及應用，旨在解決現有技術中無法大量制備高純度的抗石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白的納米抗體的問題。

為實現上述申請目的，本申請采用的技術方案如下：

第一方面，本申請提供一種抗石斑魚神經壞死病毒納米抗體的制備方法，包括如下步驟：

獲取免疫羊駝的外周血淋巴細胞的總RNA，并進行反轉錄擴增得到cDNA序列；

以所述cDNA序列為模板擴增羊駝抗體VHH基因，將所述羊駝抗體VHH基因與載體連接得到連接產物，將所述連接產物進行轉化構建噬菌體展示文庫；