[發(fā)明專利]一種基于NMR的Arf6特異性鳥(niǎo)苷酸交換因子GEF的活性檢測(cè)方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110359823.3
• 申請(qǐng)日: 2021-04-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115165948A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-10-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王俊峰;王嘉榕;吳勃
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): G01N24/08
• 分類號(hào): G01N24/08;G01N33/68
• 代理公司: 北京尚誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 龍淳;葉占洋

1.一種基于NMR的Arf6特異性鳥(niǎo)苷酸交換因子GEF的活性檢測(cè)方法，其包括以下步驟：

1)提供一種¹⁹F位點(diǎn)特異性非天然氨基酸標(biāo)記的Arf6重組蛋白的GDP態(tài)蛋白，檢測(cè)并記錄其¹⁹F NMR一維光譜R0；

2)將待檢測(cè)的Arf6特異性鳥(niǎo)苷酸交換因子GEF樣品與步驟1)提供的¹⁹F位點(diǎn)特異性非天然氨基酸標(biāo)記的Arf6重組蛋白的GDP態(tài)蛋白混合，并加入GTP或其類似物，獲得混合體系；

3)在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)所述混合體系檢測(cè)并記錄其一系列¹⁹F NMR一維光譜R1、R2、R3、……、Rn，所述一維光譜中包含代表¹⁹F位點(diǎn)特異性非天然氨基酸標(biāo)記的Arf6重組蛋白的GDP態(tài)的第一譜峰和代表¹⁹F位點(diǎn)特異性非天然氨基酸標(biāo)記的Arf6重組蛋白的GTP態(tài)的第二譜峰，其中所述GTP態(tài)是由所述GDP態(tài)經(jīng)GEF轉(zhuǎn)化獲得；

4)分別對(duì)所述一維光譜R0、R1、R2、R3、……、Rn中的第一譜峰和第二譜峰進(jìn)行峰下面積積分，其中所述第一譜峰下面積表示GDP態(tài)含量，所述第二譜峰下面積表示GTP態(tài)含量，分別獲得各一維光譜中所述第一譜峰和第二譜峰對(duì)應(yīng)的GDP態(tài)含量和GTP態(tài)含量；

5)以記錄的一維光譜R0、R1、R2、R3、……、Rn的時(shí)間為橫坐標(biāo)，以GTP態(tài)含量/(GTP態(tài)含量+GDP態(tài)含量)為縱坐標(biāo)擬合繪制得到GEF的作用動(dòng)力學(xué)曲線，表征Arf6特異性鳥(niǎo)苷酸交換因子GEF的活性；

步驟1)中所述¹⁹F位點(diǎn)特異性非天然氨基酸標(biāo)記的Arf6重組蛋白為Arf6蛋白的第47位氨基酸取代為¹⁹F標(biāo)記的三氟甲基苯丙氨酸的重組蛋白。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性檢測(cè)方法，步驟2)中所述混合體系中待檢測(cè)的Arf6特異性鳥(niǎo)苷酸交換因子GEF樣品中GEF和¹⁹F位點(diǎn)特異性非天然氨基酸標(biāo)記的Arf6重組蛋白的GDP態(tài)蛋白的摩爾比為：1：(100～10000)；優(yōu)選為1：(500～4800)；

所述混合體系中¹⁹F位點(diǎn)特異性非天然氨基酸標(biāo)記的Arf6重組蛋白的GDP態(tài)蛋白和GTP或其類似物的摩爾比為1：(5～10)；優(yōu)選地，GTP類似物包括但不限于GTPγS。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的活性檢測(cè)方法，其中所述¹⁹F位點(diǎn)特異性非天然氨基酸標(biāo)記的Arf6重組蛋白通過(guò)以下步驟獲得：

P1)將Arf6基因連接入含有His標(biāo)簽的pBAD/His A表達(dá)載體中，獲得pBAD/His A-Arf6重組表達(dá)載體；

P2)將pBAD/His A-Arf6重組表達(dá)載體中Arf6基因的第47位密碼子突變?yōu)門AG，獲得Arf6基因第47位密碼子為TAG的pBAD/His A-Arf6重組載體；

P3)將步驟P2)獲得的Arf6基因第47位密碼子為TAG的pBAD/His A-Arf6重組載體與pDule-tfmF質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)表達(dá)獲得¹⁹F位點(diǎn)特異性非天然氨基酸標(biāo)記的Arf6重組蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的活性檢測(cè)方法，其中步驟2)中所述待檢測(cè)的Arf6特異性鳥(niǎo)苷酸交換因子GEF樣品選自ARNO蛋白；純化的ARNO-Sec7重組蛋白，其包含ARNO蛋白第51-252位氨基酸；GEP100；EFA6；細(xì)胞裂解液；生物體組織裂解液；或其組合。

5.一種用于權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的Arf6特異性鳥(niǎo)苷酸交換因子GEF的活性檢測(cè)方法的¹⁹F位點(diǎn)特異性非天然氨基酸標(biāo)記的Arf6重組蛋白，其由攜帶有第47位密碼子為TAG的Arf6基因的pBAD/His A-Arf6重組載體與pDule-tfmF質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)獲得。