[發明專利]一種用于妊娠期糖尿病腸道菌群檢測16S rDNA擴增子建庫方法

在審

• 申請號: 202110359724.5
• 申請日: 2021-04-02
• 公開（公告）號: CN113046418A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 武漢博越致和生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于妊娠期糖尿病腸道菌群檢測16S rDNA 擴增子建庫方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟A樣品預處理

步驟A-1將300mg左右的糞便樣品放入2ml離心管，加入1ml的PBS（0.1mol/L pH7.4）,20μl 20%PVPP，充分振蕩混勻

步驟A-2室溫下2000r/min 離心6min，取上清液，沉淀中再加入1ml的PBS混勻，離心，取上清液；

步驟A-3合并兩次的上清液，12000r/min離心6min，收集沉淀；

步驟B腸道菌群樣本DNA提取

步驟B-1在預處理的樣本中依次加入300 μl裂解液1（0.15mol/L NaCl 0.1mol/LNa₂EDTA,PH8.0）100mg/ml溶菌酶100 μl, 5 μl蛋白酶K（10mg/ml），37℃下500r/min振蕩30min；

步驟B-2加入300 μl裂解液2（10%SDS,0.1mol/L NaCl,0.5mol/L Tris-HCl,pH8.0）,50μl20%PVPP,65℃保溫10min，加入750 μl Tris-飽和酚：氯仿：異戊醇（25：24:1），混合振蕩2min，13000r/min離心8min；

步驟B-3將步驟B-2步驟的上清液轉入另一2ml離心管：加入等體積的Tris-飽和酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）混合振蕩2min，13000r/min離心8min；

步驟B-4取上清液轉入另一2ml離心管：加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉和2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀2h：13000r/min離心15min；

步驟B-5沉淀用70%冰乙醇洗滌一次，自然風干；

步驟B-6 最后用50 μl去離子水溶解，-20℃保存。

2.根據權利要求1所述的文庫構建方法，其特征在于步驟C進一步質控：

步驟C樣本質量控制

步驟C-1從步驟B提取的DNA 1 μL，用Qubit3.0檢測DNA的濃度；

步驟C-2吸取1 μL提取的DNA，NanoDrop200檢測DNA濃度和吸光值；選擇濃度大于10ng/ul，OD260/280=1.8-2.0的DNA進行后續文庫構建

步驟C-3吸取2 μL提取的DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。

3.根據權利要求2所述的質檢的樣本，其特征在于步驟D通過對步驟B的DNA進行16srDNA進行一步擴增：

步驟D擴增16S rDNA的 V3-V4區域

步驟D-1樣品混勻離心

步驟D-2使用的正向引物為341F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG反向引物為806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT進行擴增并純化，加入2 μl的基因組DNA，P5,P7引物各1μl

加入dNTP MIX 4 μl，Prime STAR GXL1 μl，5xPS GXL Buffer10 μl，用無菌水將體系控制在31 μl

具體配比見下表：

按下列表格配置體系

。

4.根據權利要求3所述擴增出來的PCR產物，其特征在于需對步驟D進行一步PCR富集，

樣品混勻，短暫離心，跑膠觀察，文庫的片段長度圖2文庫結構示意圖如圖3，

步驟D-2 PCR程序設置如下：

。