[發明專利]一種適用于簡化轉錄組測序的文庫構建方法及配套試劑盒

在審

• 申請號: 202110359574.8
• 申請日: 2021-04-02
• 公開（公告）號: CN112941636A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 武漢博越致和生物科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種簡化轉錄組測序文庫的構建方法，包括以下步驟：

步驟A：總RNA提取與質量控制，進行RNA標記，反轉錄成cDNA；

步驟B：對cDNA進行片段化文庫的構建，從而得到簡化轉錄組測序文庫。

2.根據權利要求1所述的構建方法，所述步驟A包括：

步驟A-1：總RNA提取與質量控制；

步驟A-2：標記RNA，cDNA第一條鏈合成；

步驟A-3：樣品混池；

步驟A-4：混池后進行柱純化；

步驟A-5：cDNA第二條鏈合成；

步驟A-6：選用KAPA磁珠對合成產物進行純化。

3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于步驟A-2：標記RNA，cDNA第一條鏈合成包括兩個反應體系，反應體系一65℃孵育5分鐘后立即至冰上，反應體系二42℃進行50分鐘，70℃進行15分鐘；步驟步驟A-4：cDNA第二條鏈合成包括16℃孵育2.5小時。

4.根據權利要求1所述的構建方法，所述步驟B包括：

步驟B-1：cDNA文庫的片段化純化，對純化后的cDNA片進行段末端修復，得到平末端的DNA片段，將平末端的DNA片段連接上接頭，得到加接頭的DNA片段；

步驟B-2：樣品混池后進行柱純化；

步驟B-3：對加接頭的DNA片段進行PCR擴增；

步驟B-4：選用KAPA磁珠對擴增產物進行純化，片段篩選得到簡化轉錄組測序文庫。

5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于所述步驟B-1中采用一步法得到加接頭DNA片段包括55℃孵育10分鐘。

6.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于所述步驟B-3 PCR反應程序包括變性、退火、延伸步驟；變性步驟可在98℃進行0.2分鐘；退火步驟可在63℃進行0.5分鐘；延伸步驟可在72℃進行0.5分鐘；由上述變性、退火、延伸步驟組成的循環可進行10個。

7.根據權利要求6所述的構建方法，其特征在于所述PCR在溫度循環步驟前的模板其特征在于所述PCR在溫度循環步驟前的模板可在72℃進行3分鐘和98℃進行0.5分鐘的熱處理。

8.一種用于按如權利要求2-7任一所述的方法構建簡化轉錄組測序文庫的配套試劑盒，其特征在于，該配套試劑盒包括：BU3_primers x96（10μM）（Microsynth）；dNTP(0.2mM)；TSO（10μM）；RT buffer；SuperScript? II Reverse Transcriptase（Lifetech）；RNAse H（NEB）；Escherichia coli DNA ligase（NEB）；E. coli DNA Polymerase（NEB）；dNTP (0.2mM)；5XSecond Stand Buffer(100mM Tris-HCl (pH 6.9)；MgCl₂；KCl；β-NAD；(NH4)₂SO₄；0.6Xbeads（KAPA）；Tn5-B/B(11μM)；5XTAPS buffer（50mM TAPS）；MgCl₂；NEB Next High-Fidelity 2X PCR Master Mix（NEB）；P5_BRB primer(5μM)（Illumina）；oligo bearingIllumina index（Illumina）；0.5Xbeads(KAPA)；0.7Xbeads（KAPA）。