[發明專利]一種豬毛乳頭細胞的培養方法

有效

• 申請號: 202110359546.6
• 申請日: 2021-04-02
• 公開（公告）號: CN113061570B
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 丁向東;秦晉;鄒全;蔣堯
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京成實知識產權代理有限公司 11724
• 代理人: 陳永虔

1.一種豬毛乳頭細胞的培養方法，其特征在于，所述豬毛乳頭細胞取自豬耳皮膚組織，所述豬耳皮膚組織來自屠宰后半小時內豬只耳朵較薄部位的皮膚組織，在不卷曲的情況下置于離心管中，并用生理鹽水浸沒，8-10小時內完成豬毛乳頭細胞分離培養操作；

有關毛乳頭細胞的培養方法具體包括如下步驟：所述豬毛乳頭細胞取自上述耳樣，具體包括如下步驟：

S1、將耳樣從生理鹽水中取出，將耳樣皮膚剪成1.5cm*4cm狀長條，在生理鹽水中清洗，刮去表面臟物，隨后放到碘伏溶液中清洗2min；

再放到生理鹽水中清洗，然后放到75%酒精溶液中進行清洗2min；

再一次將耳樣放到生理鹽水中清洗，然后放到PBS中進行清洗2min，最后放到生理鹽水中清洗干凈；

S2、將S1處理好的耳樣邊緣部分剪掉棄之，先去掉表皮長毛的部分，再去掉表皮層和軟骨，將剩余組織剪成米粒大小的組織顆粒；

S3、將S2獲得的組織顆粒置于離心管中，加入Ⅰ型膠原酶，使其浸沒上述組織顆粒，37℃消化4-5h，每間隔10-15min吹打，并搖晃樣品；

所述Ⅰ型膠原酶濃度為1.5mg/ml，配制方法為：在37°C條件下，將Ⅰ型膠原酶溶于TESCA緩沖液中，然后分裝保存于-20°C；

S4、消化4-5小時后，加入胎牛血清培養基終止消化，1200r/min離心5min，棄掉上層液體；

S5、在S4步驟獲得的離心管中加入0.25%胰酶進行消化10-20min，加入胎牛血清培養基終止消化；

S6、將上述混合物轉移到培養皿中，并放到顯微鏡下觀察，挑選完整的毛乳頭，放到另一新的培養皿中，新的培養皿要預先加入胎牛血清培養基；

S7、在顯微鏡下利用5mm針頭對上述培養皿中毛乳頭周圍粘連部分進行清除；

S8、對S7中的毛乳頭進行挑選，轉移至裝有DMEM培養基的新培養皿中，并用DMEM培養基對其清洗2-3次；

S9、將S8處理好的毛乳頭均勻的貼附于預先鋪有鼠尾膠原的6孔細胞培養板中，所述細胞培養板的培養孔內要預先加入少量胎牛血清培養基，待毛乳頭貼壁再加入1ml胎牛血清培養基，所述毛乳頭從貼附到貼壁需要24小時；

S10、將上述毛乳頭留置上述細胞培養板中培養一周后可進行正常傳代，傳代時間為49-50h。

2.根據權利要求1所述豬毛乳頭細胞的培養方法，其特征在于，所述鼠尾膠原溶液濃度為1mg/mL，配制方法為：取5ml0.1mol/L的醋酸溶液加入到15ml的離心管中，加入5mg的鼠尾膠原，在室溫下持續攪拌1-3小時直至溶解，配制成1mg/mL的鼠尾膠原溶液。

3.根據權利要求1所述豬毛乳頭細胞的培養方法，其特征在于，所述胎牛血清培養基的配制方法為：在DMEM基礎培養基中加入15%胎牛血清。