[發(fā)明專利]一種草魚輸尿管組織細(xì)胞系及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110359335.2
• 申請(qǐng)日: 2021-04-02
• 公開（公告）號(hào): CN113234660B
• 公開（公告）日: 2022-12-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 歐陽征亮;高任;陳瑞愛;吉華松
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12N7/00;A01N1/02;C12R1/91
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 肖宇揚(yáng)

本發(fā)明公開了一種草魚輸尿管組織細(xì)胞系，命名為草魚輸尿管組織細(xì)胞系CiU，該細(xì)胞系于2019年5月16日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏登記入冊(cè)編號(hào)為CCTCC NO：C201978，請(qǐng)求保藏人為肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司。該細(xì)胞系能在低至3％血清培養(yǎng)液中生長良好，目前已經(jīng)穩(wěn)定傳至100代以上，凍存后細(xì)胞復(fù)蘇率90％以上，復(fù)蘇細(xì)胞能夠貼壁并生長分裂，并可以正常傳代，細(xì)胞形態(tài)與增殖能力同凍存前無明顯差異。該細(xì)胞系對(duì)于草魚出血病毒Ⅱ型、草魚出血病毒GCHV?892毒株非常敏感，可用于草魚出血病疫苗的生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種草魚輸尿管組織細(xì)胞系CiU及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

草魚是鯉科、草魚屬魚類，棲息于平原地區(qū)的江河湖泊，一般喜居于水的中下層和近岸多水草區(qū)域。草魚是中國重要的淡水養(yǎng)殖魚類，它和鰱、鳙、青魚一起，構(gòu)成了中國的“四大家魚”。在養(yǎng)殖過程中，草魚容易發(fā)生各種疾病，而近年來由于各地忽視了免疫工作，草魚出血病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。草魚出血病毒(grass carp hemorrhage virus,GCHV，國際病毒分類委員會(huì)稱之為reovirus of grass carp,GCRV)是中國分離的第一種魚類病毒，隸屬呼腸孤病毒科，水生動(dòng)物呼腸孤病毒屬，直徑70～80nm，20面體球形顆粒，含有11個(gè)片段的雙鏈RNA。該病毒主要引起中國淡水養(yǎng)殖主要品種草魚在魚種階段發(fā)生出血病，死亡率高達(dá)90％以上，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。

目前草魚出血病病原公認(rèn)的至少有3個(gè)基因型，最早于1980年分離和研究的屬于基因I型(如GCHV-873株等)；而張超、王慶等于2010年首次報(bào)道了II型草魚出血病病毒，GCHV-HZ08株；Fan YD,Rao SJ等于2009年在國內(nèi)首次分離并報(bào)道了III型草魚出血病病毒：HGDRV(GCHV-104株)；不同基因型毒株間的各節(jié)段序列同源性相似性為15.1-46.1％不等，且不同基因型的交叉保護(hù)率低，這也就意味著即使免疫過單種疫苗，也仍然會(huì)有被其他基因型病原感染的風(fēng)險(xiǎn)。目前，草魚出血病活疫苗(GCHV-892株)已經(jīng)能夠?qū)騃型達(dá)到較好的免疫保護(hù)作用。而II型GCRV作為目前主要流行株型，對(duì)草魚的致病性較強(qiáng)、致死率高，尚沒有針對(duì)性的高效疫苗。

魚類原代細(xì)胞系的建立技術(shù)目前是一種較為成熟的技術(shù)，但是要獲得針對(duì)病毒敏感的細(xì)胞系仍存著很大的偶然性和困難性，所以建立一株需求魚類細(xì)胞系有效的途徑是以數(shù)量對(duì)質(zhì)量，即制備大批量的原代細(xì)胞株，從而篩選出敏感的細(xì)胞系。草魚吻端成纖維細(xì)胞系PSF是目前草魚出血病活疫苗(GCHV-892株)生產(chǎn)用細(xì)胞系，已經(jīng)在草魚出血病毒培養(yǎng)和疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，但是匯合度為80-90％的PSF細(xì)胞貼壁培養(yǎng)2-3天后，細(xì)胞生長為長梭形，對(duì)病毒的敏感性下降。草魚出血病II型在細(xì)胞上不產(chǎn)生病變，在目前常用于分離GCRV的CIK、PSF、FHM、EPC等細(xì)胞系上擴(kuò)繁拷貝數(shù)低，難以滿足草魚呼腸孤病毒II型的分離、繁殖及草魚出血病疫苗研究的要求。為了研究及預(yù)防該病毒，技術(shù)人員需要一種對(duì)草魚出血病毒有更強(qiáng)敏感性的細(xì)胞系。

一般的魚類有一對(duì)輸尿管，腎臟過濾的新陳代謝廢物由腎小管匯集到輸尿管，借助輸尿管肌肉壁的蠕動(dòng)將尿液排出體外。輸尿管壁具有三層：粘膜層、肌肉層、纖維層。粘膜層有較多縱行皺褶；肌肉層里層為縱肌，外層為環(huán)肌，均屬于滑肌；纖維層有較多彈性結(jié)締組織、血管、神經(jīng)分布期間。但是，目前還沒有關(guān)于草魚輸尿管組織細(xì)胞系的報(bào)道，更沒有關(guān)于草魚輸尿管組織細(xì)胞系用于培養(yǎng)草魚出血病病毒的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明以草魚輸尿管組織為對(duì)象，成功構(gòu)建了草魚輸尿管組織細(xì)胞系，該細(xì)胞系不僅能用于草魚出血病病毒Ⅱ型的增殖，還能用于草魚出血病疫苗的生產(chǎn)。

本發(fā)明所述的草魚輸尿管組織細(xì)胞系的生物學(xué)名稱為草魚輸尿管組織細(xì)胞系CiU，該細(xì)胞系于2019年5月16日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為：中國.武漢.武漢大學(xué)，郵編：430072，保藏登記入冊(cè)編號(hào)為CCTCC NO：C201978，請(qǐng)求保藏人為肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司。