[發(fā)明專利]一種L-蘋果酸脫氫酶突變體及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110359271.6
• 申請日: 2021-04-02
• 公開（公告）號: CN113061593A
• 公開（公告）日: 2021-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范文超;高書良;丁鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 洛陽華榮生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 上海申浩律師事務(wù)所 31280
• 代理人: 賈師英

本發(fā)明公開了一種L?蘋果酸脫氫酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4，與野生型L?蘋果酸脫氫酶相比，顯著提高了酶活力。該L?蘋果酸脫氫酶突變體能夠通過酶促拆分DL?蘋果酸來生產(chǎn)高光學(xué)純度的D?蘋果酸和草酰乙酸。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶催化技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種L-蘋果酸脫氫酶突變體、及其用于生產(chǎn)D-蘋果酸和草酰乙酸的用途。

背景技術(shù)

蘋果酸，又名2-羥基丁二酸，由于分子中有一個不對稱碳原子，故存在兩種立體異構(gòu)體L-蘋果酸和D-蘋果酸。天然存在的蘋果酸都是L-型的，幾乎存在于一切果實(shí)中，以仁果類中最多，也可由延胡索酸經(jīng)生物發(fā)酵制得。它是人體內(nèi)部循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，易被人體吸收，因此作為性能優(yōu)異的食品添加劑和功能性食品廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)療和保健品等領(lǐng)域。DL-蘋果酸可由延胡索酸或馬來酸在催化劑作用下于高溫高壓條件和水蒸氣作用制得。因?yàn)槿梭w不易代謝D-蘋果酸，因而不允許DL-蘋果酸作為添加劑。隨著醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展，D-蘋果酸在醫(yī)藥工業(yè)中有越來越廣泛的用途，例如，D-蘋果酸作為手性前體可用于手性藥物的合成，用作原料合成抗生素、抗病毒藥物、抗組胺藥物等。

D-蘋果酸的制備方法主要有化學(xué)合成法、外消旋體的物理和化學(xué)拆分法、生物法。化學(xué)合成及拆分法制備D-蘋果酸成本較高，一直處于研究階段。生物法制備D-蘋果酸主要通過微生物自身誘導(dǎo)表達(dá)L-蘋果酸脫氫酶的微生物由馬來酸制備D-蘋果酸；此外，參見CN110747190A，還有大腸桿菌表達(dá)L-蘋果酸脫氫酶來全細(xì)胞催化制備D-蘋果酸，產(chǎn)物濃度都可以達(dá)到200g/L以上，通過微生物自身誘導(dǎo)表達(dá)L-蘋果酸脫氫酶的微生物培養(yǎng)條件復(fù)雜，微生物生長濃度不高，同時，產(chǎn)物中會含有少量的L-蘋果酸、DL-蘋果酸，蘋果酸二聚體等難以分離的物質(zhì)，提純比較困難，造成工業(yè)化生產(chǎn)成本較高，無法滿足市場需求。

采用一種專一高效的L-蘋果酸脫氫酶，以DL-蘋果酸為底物，將其中的L-蘋果酸脫氫轉(zhuǎn)化成為草酰乙酸，然后分別純化提起D-蘋果酸和草酰乙酸，是一個可供選擇的替代方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了探索酶促拆分法制備D-蘋果酸的工業(yè)化可行性，我們將研究方向關(guān)注在L-蘋果酸脫氫酶(MDH，EC1.1.1.37)的利用上，并對于各種來源的L-蘋果酸脫氫酶進(jìn)行了篩選和比較。

L-蘋果酸脫氫酶廣泛存在于自然界的各種生物中，需要以NADP⁺(少數(shù)可以NAD⁺)為輔因子，可逆地催化L-蘋果酸到草酰乙酸，是三羧酸循環(huán)(TCA cycle)的關(guān)鍵酶。源于冷海水黃桿菌(Flavobacterium frigidimaris KUC-1)的蘋果酸脫氫酶(ffMDH)(SEQ ID NO:1)可以特異地催化L-蘋果酸的氧化和草酰乙酸的還原，并能同時以NAD⁺和NADP⁺作為輔因子，但ffMDH熱穩(wěn)定性較差，因此通過定向誘變獲得高酶活性和立體選擇性的突變酶是本發(fā)明的目標(biāo)。經(jīng)過高通量篩選和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終獲得一些酶活力顯著提高的L-蘋果酸脫氫酶突變體ffMDHmut，通過大腸桿菌過表達(dá)密碼子優(yōu)化的ffMDHmut基因和LreNox基因，再輔以NADH/NADPH氧化酶進(jìn)行全細(xì)胞催化，可高效制備D-蘋果酸和草酰乙酸，有望在工業(yè)化生產(chǎn)中得到應(yīng)用。

具體而言，本發(fā)明包含如下技術(shù)內(nèi)容。

一種L-蘋果酸脫氫酶突變體，其氨基酸序列為：

SEQ ID NO:3，其為SEQ ID NO:1第65位的Y替換為D、第139位的R替換為L、第231位的A替換為V的突變體，其氨基酸序列為：