[發明專利]一種重組溶組織梭菌I型膠原酶及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202110358896.0
• 申請日: 2021-04-02
• 公開（公告）號: CN113025599B
• 公開（公告）日: 2023-09-12
• 發明（設計）人: 李樹剛;張偉;但國平;鄧永康;李曉麗;曹莉君;劉濤;辛渝;楊丹丹;于廷和
• 申請（專利權）人: 重慶科潤生物醫藥研發有限公司
• 主分類號: C12N9/52
• 分類號: C12N9/52;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;A61K38/48;A61P43/00;A61P15/00;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種重組溶組織梭菌I型膠原酶的融合蛋白，包含溶組織梭菌I型膠原酶和連接到所述溶組織梭菌I型膠原酶N端的標簽蛋白；所述標簽蛋白包含串聯的鈣調蛋白結合肽(CBP)與鏈球菌抗生物素蛋白結合肽(SBP)。本發明還提供了上述重組溶組織梭菌I型膠原酶的融合蛋白的制備方法和應用。本發明利用CBP?SBP作為融合標簽，可高效促進溶組織梭菌I型膠原酶(ColG)可溶表達，避免了包涵體復性，有利于純化降低生產成本，能夠滿足工業化生產的需求。

技術領域

本發明涉及生物工程領域，特別涉及一種高純度重組溶組織梭菌I型膠原酶及其制備方法和應用。

背景技術

溶組織梭菌型膠原酶(Collagenase?Clostridium?Histolyticum)為BioSpecifics?Technologies集團原研的藥物，其于2010年2月2日獲得美國食品藥品管理局(FDA)批準，2011年2月28日獲得歐洲藥物管理局(EMA)批準，2015年7月3日獲得日本醫藥品醫療器械綜合機構(PMDA)批準上市。商品名為的產品由Auxilium制藥(現在的遠藤制藥，Endo?International)在美國市場銷售，由旭化成(Aasahi?Kasei)在日本市場銷售。商品名為的產品由Swedish?Orphan?Biovitrum(SOBI)在歐洲市場銷售。此外，商品名為和的產品由BioSpecifics?Technologies集團銷售。

批準的適應癥有杜普征氏掌攣縮(Dupuytren’s?contracture)、佩羅尼病(Peyronie’s?disease)以及橘皮組織(Cellulite)。是第一個獲FDA批準用于佩羅尼病男性患者的非手術治療選擇。由梭菌屬I型膠原酶(AUX-I)和梭菌屬II型膠原酶(AUX-II)，按1:1的質量比混合而成。AUX-I和AUX-II均為單一肽鏈，分別由溶組織梭菌的ColG和ColH編碼，二者都是鋅離子、鈣離子結合的金屬酶。

生理學條件下膠原酶的作用是水解天然三重螺旋構象的膠原，可使沉積膠原溶解。注射到杜普征氏掌攣縮患者的可觸摸結締中或佩羅尼病患者的陰莖硬結中(二者主要成分就是沉積的膠原)使之破壞。體外研究表明AUX-I和AUX-II依據各自不同的底物親和性、水解效率以及選擇性切割位點而發揮協同作用。

原研公司BioSpecifics是通過培養溶組織梭菌，從發酵上清液中純化AUX-I和AUX-II。但是溶組織梭菌本身是一種氣性壞疽的致病菌，從其發酵上清液常常混雜各種毒素，成分復雜，如果沒有原研公司的菌株以及生產和純化工藝，很難保證得到達到藥用標準的精制品。用基因重組技術生產溶組織梭菌I型膠原酶是解決這個問題的可能途徑，但由于AUX-II分子量較大(113kD)，常規大腸桿菌表達難以實現。即使表達大都在胞內積累，易形成包涵體。包涵體復性過程復雜、技術難度大、得率低、生產成本高，當前尚不能應用于工業化生產。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于制備重組溶組織梭菌I型膠原酶的易于高效表達的標簽蛋白，該融合標簽蛋白包括來源于鈣調蛋白結合肽與鏈球菌抗生物素蛋白結合肽的串聯組合(CBP-SBP)，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:3所示，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:4所示。該融合標簽蛋白還包括：轉錄終止抗終止因子(NusA)，或者大腸桿菌硫氧還蛋白A(TrxA)，或者二硫鍵氧化還原酶(DsbA、DsbC)，或者谷胱甘肽S-轉移酶(GST)。所述融合標簽蛋白能促進重組溶組織梭菌I型膠原酶的可溶高效表達，且不影響重組溶組織梭菌I型膠原酶的生物活性。

本發明首先提供了一種重組溶組織梭菌I型膠原酶的融合蛋白，包含溶組織梭菌I型膠原酶和連接到所述溶組織梭菌I型膠原酶N端的標簽蛋白；所述標簽蛋白包含串聯的鈣調蛋白結合肽(CBP)與鏈球菌抗生物素蛋白結合肽(SBP)；

優選地，所述鈣調蛋白結合肽(CBP)的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:5，所述鏈球菌抗生物素蛋白結合肽(SBP)的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:7；