[發明專利]一種四級生物安全實驗室病毒化學淋浴消毒驗證方法

有效

• 申請號: 202110358894.1
• 申請日: 2021-04-02
• 公開（公告）號: CN113151596B
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: 王云川;鄭吟秋;李靜美;朱凡麗;楊夢莉;孫強明
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70
• 代理公司: 昆明潤勤同創知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 53205
• 代理人: 李孝明

1.一種四級生物安全實驗室病毒化學淋浴消毒驗證方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)病毒原液制備

(2)病毒載體的制備：取適量事先配制好的粘附基質加至1.5*1.5cm的正方形載體上，后再加100ul上述病毒原液至表面，然后送入安全柜內干燥；

(3)化學淋?。簩⒏稍锖玫牟《据d體粘在正壓防護服頭部、左腋下、前胸、后背、褲襠、右腳底、左手臂、右膝蓋以及左膝蓋位置處，同時設置陰性對照點；人穿著正壓防護服進入化學淋浴間，按照化學淋浴程序進行化學淋浴消毒；

(4)采樣、稀釋待測病毒液以及接種培養：對經化學淋浴結束以后的病毒載體進行采樣，并對所采樣進行稀釋，將稀釋以后的樣液進行接種培養；

(5)觀察細胞病變、計數以及計算lgTCID₅₀：對步驟(4)中接種培養后的病毒，在顯微鏡下面觀察細胞病變率；計數以后計算lgTCID₅₀；

其中，所述粘附基質為5％BSA+7％蛋白胨+20％黏蛋白，且1.5*1.5cm的正方形載體其材質與步驟(3)化學淋浴步驟中所穿的正壓防護服材質相同。

2.根據權利要求1所述的一種四級生物安全實驗室病毒化學淋浴消毒驗證方法，其特征在于，所述步驟(1)中病毒原液制備具體流程為：將細胞接種于T75細胞培養瓶中，待形態良好、長成單層時，去除原始培養基，用PBS液洗3遍，每管加入病毒后放置在二氧化碳培養箱中孵育1h，每瓶加20ml維持液，細胞培養箱中培養，每日觀測并記錄細胞病變(CPE)，待CPE出現+++～++++號時，將細胞凍融1-2次，收集上清，離心，超濾，收集病毒上清液，即得病毒原液。

3.根據權利要求1所述的一種四級生物安全實驗室病毒化學淋浴消毒驗證方法，其特征在于，所述步驟(3)中化學淋浴消毒程序為消毒劑160s-暴露60s-清水淋浴220s+洗刷輔助。

4.根據權利要求1所述的一種四級生物安全實驗室病毒化學淋浴消毒驗證方法，其特征在于，所述步驟(4)的具體過程為：

對步驟(3)的化學淋浴后的病毒載體進行采樣，將各位置的載體取下分別放入一次性平皿內，轉移至實驗室核心間的生物安全柜內，將平皿內的病毒載體用消毒過剪刀將涂抹區域剪下，分別放入裝有1.5mlDMEM緩沖液的離心管內，震蕩混勻，然后將離心管內液體吸入到新的離心管中；

對上述采樣的液根據接種的孔數進行稀釋，每個稀釋度接種4孔，每個稀釋度配1000μl，即10^-1為100μl加入900μl的孵育液中，以此類推，稀釋至10^-5；

將上述稀釋后待測病毒液接種到96孔細胞培養板，細胞培養板用多道加樣器吸去96孔板中的培養液，用PBS洗兩次，將稀釋好的病毒液加到96孔板上，每孔100μl，從右到左，從上到下，從高稀釋度到低稀釋度以及原液加樣，然后在搖床輕柔搖晃孵育1h，加入維持液100μl繼續在37℃CO₂培養箱中培養。

5.根據權利要求1所述的一種四級生物安全實驗室病毒化學淋浴消毒驗證方法，其特征在于，所述接種培養的時間為5d。

6.根據權利要求4所述的一種四級生物安全實驗室病毒化學淋浴消毒驗證方法，其特征在于，所述震蕩混勻的時間為30s-60s。

7.根據權利要求4所述的一種四級生物安全實驗室病毒化學淋浴消毒驗證方法，其特征在于，所述96孔細胞培養板選自60％-90％豐度培養板，所述高稀釋度到低稀釋度依次為10^-5，10^-4，10^-3，10^-2，10^-1，所述維持液為1％雙抗+4％FBS的DMEM培養基。

8.根據權利要求1所述的一種四級生物安全實驗室病毒化學淋浴消毒驗證方法，其特征在于，所述100ul病毒原液中含病毒超過10⁶cfu。

9.根據權利要求1至8任一項所述的一種四級生物安全實驗室病毒化學淋浴消毒驗證方法，其特征在于，所述病毒原液為新冠病毒、尼帕病毒或者是埃博拉病毒原液。