[發明專利]一種能穩定表達ABEmax蛋白的細胞株及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 202110356842.0
• 申請日: 2021-04-01
• 公開（公告）號: CN113025652B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 馬旭;張璐;金孝華;曹小芳
• 申請（專利權）人: 國家衛生健康委科學技術研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12N15/55
• 代理公司: 北京迎碩知識產權代理事務所(普通合伙) 11512
• 代理人: 錢揚保;張群峰

1.一種能穩定表達ABEmax蛋白的細胞株的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:

S1、設計并構建能表達ABEmax基因、抗生素篩選標記的piggyBac載體;

其中，所述ABEmax基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示; 所述抗生素篩選標記為嘌呤霉素抗性基因；利用T2A元件將嘌呤霉素抗性基因連接到PiggyBac載體的工作元件中；

ABEmax擴增引物：

ABEmax-F：atgaaacggacagccgacggaagcgagtt

ABEmax-R：gactttcctcttcttcttgggctcgaatt

PiggyBac載體擴增引物：

PiggyBac-F：aagaagaggaaagtcgaattcgaaggatccgcggccgct

PiggyBac-R：ggctgtccgtttcatggtggctctagagtaggcgccggt

S2、將擴增獲得的ABEmax產物與擴增獲得的piggyBac載體產物利用同源同組的方法連到一起，構成PiggyBac-ABEmax蛋白表達載體，將所述PiggyBac-ABEmax蛋白表達載體和轉座酶基因載體共轉入工具細胞293T細胞，通過抗生素篩選陽性細胞株并對篩選出的陽性細胞株進行編輯效果鑒定;

S3、將有編輯效果的細胞株經過抗生素篩選后流式分選單克隆細胞系;

S4、單克隆細胞經過PCR驗證和編輯效果驗證后即得穩定表達ABEmax蛋白的細胞株。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述ABEmax基因還包括核定位信號序列NLS。

3.如權利要求1至2任一項所述的制備方法得到的細胞株。

4.一種制備堿基編輯細胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟:使用如權利要求3所述的細胞株作為工具細胞進行后續堿基編輯操作，獲得所述堿基編輯細胞系。