[發明專利]一種釀酒酵母表達長效重組人bFGF-HSA融合蛋白及其標準品的制備方法

在審

• 申請號: 202110355040.8
• 申請日: 2021-04-01
• 公開（公告）號: CN113201554A
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 趙俊;許高濤;凡玉芳;劉家爐;孔國慶;周煒;何志遠
• 申請（專利權）人: 蕪湖英特菲爾生物制品產業研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/66;C12N15/62;C07K19/00;C07K1/22;C07K1/18;C07K1/34;C07K1/36;C12R1/865
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 王萍

1.一種釀酒酵母表達長效重組人bFGF-HSA融合蛋白制備方法，其特征在于，包含以下步驟：

(1)釀酒酵母分泌表達載體pYES2/CT-MFα-bFGF-HSA的構建，具體包括：

人堿性成纖維細胞生長因子和人血清白蛋白因子的人工優化和獲得，以獲得質粒pMD19-T-bFGF-HSA；

對質粒pYES2/CT-MFα及質粒pMD19-T-bFGF-HSA進行雙酶切，并分別切膠回收bFGF-HSA基因片段和pYES2/CT-MFα載體片段，然后用T4 DNA連接酶進行連接，經含氨芐青霉素的LB平板培養基篩選獲得陽性克隆pYES2/CT-MFα-bFGF-HSA；

(2)bFGF-HSA融合蛋白工程菌的制備、轉化，具體包括：

釀酒酵母表達體系常用溶液及培養基的配制；

將步驟(1)獲得的pYES2/CT-MFα-bFGF-HSA電轉化釀酒酵母INVSc1感受態細胞，通過培養基的培養及PCR擴增、篩選，獲得陽性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-bFGF-HSA；

(3)INVSc1/pYES2/CT-MFα-bFGF-HSA工程菌的誘導表達和純化，具體包括：

將步驟(2)獲得的陽性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-bFGF-HSA，通過培養、誘導表達，再依次經過金屬離子親和層析和陰離子交換層析純化，即得本發明所需釀酒酵母表達重組人bFGF-HSA融合蛋白。

2.根據權利要求1所述的一種釀酒酵母表達長效重組人bFGF-HSA融合蛋白制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中，人堿性成纖維細胞生長因子和人血清白蛋白因子的人工優化和獲得，以獲得質粒pMD19-T-bFGF-HSA，具體步驟為：

根據pYES2/CT-MFα載體的性質和釀酒酵母宿主密碼子偏愛性，設計了重組人bFGF-HSA基因序列和重組人bFGF-HSA的氨基酸序列，重組人bFG F-HSA基因序列如序列表1所示，重組人bFGF-HSA的氨基酸序列如序列表2所示；

將序列以bFGF-HSA順序插入pMD19-T Simple Vector，其5’端接NotⅠ酶切位點，3’端接XbaⅠ酶切位點，由此得到質粒pMD19-T-bFGF-HSA。

3.根據權利要求1所述的一種釀酒酵母表達長效重組人bFGF-HSA融合蛋白制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中，對質粒pYES2/CT-MFα及質粒pMD19-T-bFGF-HSA進行雙酶切，并分別切膠回收bFGF-HSA基因片段和pYES2/CT-MFα載體，然后用T4 DNA連接酶進行連接，獲得陽性克隆pYE S2/CT-MFα-bFGF-HSA，具體步驟為：

用內切酶Not I和內切酶Xba I分別對質粒pYES2/CT-MFα及質粒pMD19-T-bFGF-HSA進行雙酶切；

在37℃金屬浴酶切反應3h，酶切產物經2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并分別切膠回收bFGF-HSA基因片段和pYES2/CT-MFα載體，然后用T4 DNA連接酶進行連接；

將重組質粒轉化至大腸桿菌(DH5ɑ)，在含氨芐青霉素的LB平板培養基上挑取陽性克隆，經菌液PCR及雙酶切鑒定，選取陽性克隆pYES2/CT-MFα-bFGF-HSA。

4.根據權利要求1所述的一種釀酒酵母表達長效重組人bFGF-HSA融合蛋白制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，釀酒酵母表達體系常用溶液及培養基的配制，具體方法為：

YPD培養基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g(制備固體培養基時另加20g瓊脂粉)，溶于800ml水中，定容到1L，121℃高壓滅菌20min；

SC-U選擇培養基：6.70g酵母無氮浸出物，0.15g復合氨基酸(制備SC-U選擇性平板培養基時另加20g瓊脂粉)，加去離子水900ml，121℃高壓滅菌20min，冷卻至50℃時加入100ml過濾除菌的20％葡萄糖溶液，混勻，4℃保存備用；

SC-U誘導培養基：6.70g酵母無氮浸出物，0.15g復合氨基酸，加去離子水800ml，121℃高壓滅菌20min，冷卻至50℃時加入100ml過濾除菌的20％葡萄糖溶液和100ml過濾除菌的20％半乳糖溶液，混勻，4℃保存備用。