[發明專利]一種釀酒酵母表達人rVEGF-HSA融合蛋白及其標準品的制備方法

在審

• 申請號: 202110354981.X
• 申請日: 2021-04-01
• 公開（公告）號: CN113105557A
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 趙俊;王夢;劉潔;李誠茹;夏潔;吳博;蔣敏之
• 申請（專利權）人: 蕪湖英特菲爾生物制品產業研究院有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;C07K1/18;C12N15/62;C12N15/81
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 王萍

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種釀酒酵母表達人rVEGF?HSA融合蛋白的制備方法，通過設計并獲得rVEGF?HSA基因序列和融合蛋白rVEGF?HSA的氨基酸序列，獲得表達載體pYES2/CT?MFα?rVEGF?HSA的構建，培養并獲得轉化rVEGF?HSA融合蛋白工程菌，再進一步擴大培養并誘導表達，獲得純化后的釀酒酵母表達人rVEGF?HSA融合蛋白。本發明還提供了一種釀酒酵母表達人rVEGF?HSA融合蛋白標準品的制備方法。本發明利用釀酒酵母表達人rVEGF與HSA融合而成的重組蛋白(rVEGF?HSA)，生產工藝簡單、表達穩定。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種釀酒酵母表達人rVEGF-HSA融合蛋白及其標準品的制備方法。

背景技術

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)能夠特異地作用于血管內皮細胞，是上調血管生成的重要細胞因子。VEGF具有促進胚胎發育、促進新血管形成、增加缺血組織血流量以及降低組織損傷的生理功能。VEGF的基因定位于6p12，由8個外顯子和7個內含子交替排列構成，其mRNA以不同剪切方式形成VEGF₁₂₁、VEGF₁₄₅、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₃、VEGF₁₈₉和VEGF₂₀₆ 6種不同的異構體，其中VEGF₁₆₅發揮主要的生物學活性功能。VEGF₁₆₅包含165個氨基酸殘基，是一個二硫鍵連接的同型二聚體。體外實驗證實，乳腺癌細胞株MCF7、人宮頸癌細胞株HeLa以及黑色素瘤細胞株A375等很多腫瘤細胞株分泌VEGF₁₆₅。

人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)是人體血液中的主要蛋白，由585個氨基酸構成，是人體循環系統內的含量最多的可溶性蛋白，在血液中的濃度為34～54g/L。HSA由肝臟合成，血清半衰期長，可達19天。HSA在調節血液滲透壓、營養和促進傷口愈合等方面發揮重要作用，廣泛用于肝硬化腹水、燒傷、休克等臨床治療。此外，HSA具有無免疫原性、人體相容性好、組織分布廣和無酶活等特性，使其成為非常理想的重組蛋白融合載體。通過構建融合蛋白技術能夠增加重組蛋白的分子量從而延長半衰期，有效的提高重組蛋白的穩定性。

VEGF融合HSA表達能有效提高重組蛋白的穩定性，且生產工藝簡單、成本低、產物均一、無免疫原性。對于生物制品來說，質量評價的有效性指標常采用生物學方法，而這些方法本身變異性較大，所以標準品是生產中必不可少的組成部分。在生物制品標準化、質量控制和效力評價中，標準品是評價產品質量的重要標尺。

目前VEGF的獲得主要通過兩條途徑：一是從生物的組織細胞中提取；二是運用基因工程技術構建表達載體，利用宿主表達重組VEGF。天然提純VEGF工藝復雜、成本高，其推廣應用受到了限制，而利用基因工程技術表達外源基因已成為獲取目的蛋白的高效途徑之一，根據表達載體和宿主菌的不同，主要分為原核表達和真核表達。原核表達系統雖成本低廉，但該系統存在容易形成包涵體、獲得的蛋白生物學活性較低等缺陷。

發明內容

為克服背景技術中的技術問題，本公司利用釀酒酵母表達人VEGF與HSA融合而成的重組蛋白(rVEGF-HSA)，生產工藝簡單、成本低、產物均一，建立了一種經濟、高效、穩定表達的高濃度、高活性的長效重組人VEGF標準品蛋白，為建立人rVEGF蛋白質量標準提供依據。

一種釀酒酵母表達人rVEGF-HSA融合蛋白制備方法，包含以下步驟：

(1)釀酒酵母分泌表達載體pYES2/CT-MFα-rVEGF-HSA的構建，具體包括：

設計并獲得rVEGF-HSA基因序列和融合蛋白rVEGF-HSA的氨基酸序列；