[發明專利]一種釀酒酵母表達重組雞硫氧還蛋白及其制備方法

在審

• 申請號: 202110354978.8
• 申請日: 2021-04-01
• 公開（公告）號: CN113106076A
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 趙俊;徐文俊;周煒;何志遠;許高濤;吳蕾;吳博
• 申請（專利權）人: 蕪湖英特菲爾生物制品產業研究院有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/81
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 王萍

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種重組雞硫氧還蛋白及其制備方法，包括以下步驟：(1)釀酒酵母分泌表達載體pYES2/CT?MFα?rChTRX?His的構建；(2)pYES2/CT?MFα?rChTRX?His工程菌的制備、轉化；(3)含有pYES2/CT?MFα?rChTRX?His的釀酒酵母工程菌的搖瓶培養、誘導表達純化及檢定。本發明制備工程菌中ChTRX基因具有釀酒酵母偏愛型特點，并含有釀酒酵母信號肽，可使ChTRX分泌表達，并且大大提高了表達產物的產量，相比大腸桿菌表達系統和其他有益菌分泌表達系統而言，獲取工藝簡單，成本更低。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種釀酒酵母表達重組雞硫氧還蛋白的制備方法。

背景技術

硫氧還蛋白(Thioredoxin,TRX)是一類高度保守的低分子量蛋白質，在細胞內可溶性、對熱穩定、具有氧化還原活性的酸性小分子蛋白質，分子量約為12kDa。TRX廣泛分布于植物、細菌、酵母和動物中，它與硫氧還蛋白還原酶(TR)、還原型煙酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)三者共同組成硫氧還蛋白系統(TRX系統)，是一個有效的蛋白還原系統。TRX在其保守的活化區域內含有二硫巰基和二硫鍵，其氧化還原活性使硫氧還蛋白具有維持體內穩定的氧化還原狀態、調節細胞生長、抑制凋亡、調節基因轉錄影響蛋白在動物體內的含量、免疫調節等功能。

根據相關文獻報道，雞硫氧還蛋白的獲取方式主要有動物內臟提取純化、動物體內誘導和原核誘導表達的方式。動物內臟提取法依賴于動物組織的供給，不能規模化生產。如果采用原核表達和真核表達，該系統存在容易形成包涵體、獲得的蛋白生物學活性較低等缺陷；而采用畢赤酵母表達則需用甲醇誘導，表達產物不能直接用作于養殖業，需要提純后才能利用，生產成本高，因此選擇釀酒酵母真核表達系統對雞硫氧還蛋白進行外源表達。

發明內容

為克服背景技術中的問題，本發明提供了一種制備的重組雞硫氧還蛋白的方法，包含以下步驟：

(1)釀酒酵母分泌表達載體pYES2/CT-MFα-rChTRX-His的構建，具體包括：

雞硫氧還蛋白基因的人工優化，以獲得質粒pMD19-T-rChTRX-His；

對質粒pYES2/CT-MFα及以上膠回收的rChTRX-His片段進行雙酶切，獲得陽性克隆pYES2/CT-MFα-rChTRX-His；

(2)pYES2/CT-MFα-rChTRX-His工程菌的制備、轉化，具體包括：

釀酒酵母表達體系常用溶液及培養基的配制；

將步驟(1)獲得的pYES2/CT-MFα-rChTRX-His以及pYES2/CT-MFα質粒分別轉化釀酒酵母INVSc1感受態細胞，通過培養基的培養及PCR擴增、篩選，獲得陽性克隆子INVSc1(pYES2/CT-MFα-rChTRX-His)；

(3)含有pYES2/CT-MFα-rChTRX-His的釀酒酵母工程菌的搖瓶培養、誘導表達純化及檢定，具體包括：

將步驟(2)獲得的陽性克隆子INVSc1(pYES2/CT-MFα-rChTRX-His)，通過培養、離心、收集上清液經過柱層析，得純化后的上清蛋白液，經SDS-PAGE電泳以及鼠抗His單克隆抗體經Westernblot鑒定，均可觀察到特異性條帶，即為本發明獲得的釀酒酵母表達重組雞硫氧還蛋白。

進一步的，所述步驟(1)中，雞硫氧還蛋白基因的人工優化，以獲得質粒pMD19-T-rChTRX-His，具體步驟為：

根據雞硫氧還蛋白氨基酸序列以及釀酒酵母對密碼子的偏愛性，人工設計了釀酒酵母偏愛型重組雞硫氧還蛋白基因，重組雞硫氧還蛋白核苷酸序列為序列表1所示，重組雞硫氧還蛋白氨基酸序列為序列表2所示；