[發明專利]用于檢測胰蛋白酶類似物TrypLE的雙抗夾心ELISA檢測試劑盒及檢測方法與應用

有效

• 申請號: 202110354922.2
• 申請日: 2021-04-01
• 公開（公告）號: CN113092758B
• 公開（公告）日: 2022-11-08
• 發明（設計）人: 盧寧;梁雅麗;牛林茹;趙君;王玉哲;李文慧
• 申請（專利權）人: 山西集創生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/58
• 代理公司: 太原晉科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 14110
• 代理人: 翟沖燕

本發明屬于免疫學和生物技術領域，為了解決目前針對胰蛋白酶類似物TrypLE沒有較好的檢測方法，提供了胰蛋白酶類似物TrypLE雙抗夾心ELISA檢測試劑盒及檢測方法與應用。通過構建一種酶聯免疫吸附的方法，可以有效，快速，便捷的檢測樣品中TrypLE的含量。包括：包被有捕獲抗體的酶標板制成的固相抗體、酶標抗體、TrypLE標準品、樣品稀釋液、包被緩沖液、封閉液、ELISA酶標板洗滌液、顯色液和終止液。用于定量檢測各種生物制品的中間品、半成品和成品中胰蛋白酶的專用試劑盒。本試劑盒操作方便簡單，可直接用于樣品分析，重現性好，穩定性高。

技術領域

本發明屬于免疫學和生物技術領域，具體涉及用于檢測胰蛋白酶類似物的TrypLE雙抗夾心ELISA檢測試劑盒及檢測方法與應用。

背景技術

胰蛋白酶Trypsin (Parenzyme) 為蛋白酶的一種，是從牛、羊、豬的胰臟提取的一種絲氨酸蛋白水解酶。在脊椎動物中，作為消化酶而起作用。在胰臟是胰蛋白酶的前體胰蛋白酶原被合成后，作為胰液的成分而分泌，受腸激酶或胰蛋白酶的限制分解成為活化胰蛋白酶，是肽鏈內切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側切斷。它不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強的蛋白酶，在決定蛋白質的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。

TrypLE是一種胰蛋白酶類似物，是一種通過生物工程制備的非動物源性重組酶，目前主要應用于細胞培養中。在細胞培養中，它可以替代豬和牛的胰蛋白酶來進行對貼壁細胞的解離。TrypLE因其制備方式，一般具有較高純度，這也導致了其比天然胰蛋白酶配制劑有更強的特異性。此外，TrypLE 作用細胞時更加溫和，并且終止消化時不需要 Trypsin酶抑制劑，只需要使用稀釋液進行稀釋即可停止反應，這樣極大程度上減少了外來物質對培養細胞的干擾。TrypLE已經被證明有能力去解離來自有無血清供應培養基的細胞。

胰蛋白酶及其類似物為肽鏈內切酶，對精氨酸和賴氨酸肽鏈具有選擇性水解作用，可使天然蛋白、變性蛋白、纖維蛋白和黏蛋白等水解為多肽或氨基酸。主要應用是在細胞培養時，使細胞間的蛋白質水解，從而使細胞離散或使貼壁細胞解離下來。

Trypsin作為通過動物體提取的酶類，其不可避免的存在批間差異大與純度較低的問題，而TrypLE作為通過生物反應器的非動物源產物，其純度高，批間差異小，這也意味著其特異性更加顯著。著通過比較trypsin和TrypLE這兩種酶，我們可以發現TrypLE在諸多方面存在著更加優越的性能。Trypsin 必須保存在－20 ℃，在經過多次反復凍融或在 4℃長期保存后，穩定性喪失，TrypLE 則可以穩定的保存于室溫，節省了冷凍空間，同時提供即時可用的便利。有研究顯示，與胰蛋白酶相比，TrypLE將人胚胎干細胞克隆存活和生長狀況提高了3倍，這使得其在細胞培養中可以更有利于細胞的生、傳代。通過以上比較，可以看出TrypLE是一種極具潛力的胰蛋白酶代替物。

胰蛋白酶現行標準收載于《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版第二部，收錄的檢測項目未包含殘留量檢測，滯后于目前藥品生產與質量控制中的要求。這不僅在細胞培養過程中帶來潛在的風險，會給相關生物制品的臨床使用造成安全隱患，也是生物制品生產檢定用動物細胞基質制備及質量控制中仍需完善的一環。而TrypLE作為目前較為常用的胰蛋白酶類似物，其殘留檢測的重要性也愈發顯著。

但是，目前針對這種代替物沒有好的檢測方法，因此，有必要選用一種快速、簡便能夠定量且靈敏度、準確度和特異性高的方法來進行TrypLE的檢測。

發明內容

本發明為了解決目前針對胰蛋白酶類似物TrypLE沒有較好的檢測方法，提供了用于檢測胰蛋白酶類似物TrypLE的雙抗夾心ELISA檢測試劑盒及檢測方法與應用。通過構建一種酶聯免疫吸附的方法，可以有效，快速，便捷的檢測樣品中TrypLE的含量。