[發(fā)明專利]對(duì)木質(zhì)纖維素來(lái)源抑制物耐受提高的耐熱酵母菌株和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110353736.7
• 申請(qǐng)日: 2021-03-31
• 公開（公告）號(hào): CN112941097B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 洪泂;尚瑩瑩;王冬梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/81
• 分類號(hào): C12N15/81;C12N15/31;C12N1/19;C12P7/10;C12R1/645
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 崔亞松

本發(fā)明通過對(duì)馬克斯克魯維酵母中一個(gè)注釋為前折疊素(prefoldin)亞基4(KmPFD4))的基因在馬克斯克魯維酵母中進(jìn)行了過表達(dá)獲得一個(gè)菌株，該菌株對(duì)木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)前處理過程中產(chǎn)生的抑制物耐受能力有明顯提高。過表達(dá)菌株在含有抑制物混合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)延滯期比對(duì)照菌株明顯縮短，分別為12h和24h，在厭氧培養(yǎng)中，乙醇的產(chǎn)量和生產(chǎn)速度比對(duì)照菌株分別提高了8.93％，和46.27％。這是首個(gè)通過過表達(dá)KmPFD4基因提高抑制物耐受的耐熱酵母菌株，而該菌株的特性可以成為構(gòu)建利用木質(zhì)纖維素工程菌的重要出發(fā)菌株，其保藏號(hào)為：CGMCC No.21813。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及到生物技術(shù)領(lǐng)域。具體來(lái)說，涉及通過工程菌株改造耐熱性的馬克斯克魯維酵母，使其對(duì)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)前處理過程中的產(chǎn)生的抑制物的耐受提高。本發(fā)明建立了一個(gè)提高酵母對(duì)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)前處理過程中產(chǎn)生的抑制物耐受的方法，并構(gòu)建了具有該耐受能力的耐熱酵母菌株。

背景技術(shù)

面對(duì)化石能源逐漸枯竭、能源供應(yīng)安全、全球變暖的嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，人類對(duì)能源的需求也在急劇增加。因此，清潔、無(wú)污染、可再生能源的開發(fā)越來(lái)越得到各個(gè)國(guó)家的重視。中國(guó)具有豐富的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)資源和更低的原料和勞動(dòng)力成本，在利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物能源方面具有很大的優(yōu)勢(shì)，具有很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)能力(Callegari et al.,2020；Qu,2007)。

木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成(Brandt et al.,2013；Kumaret al.,2009)。木質(zhì)纖維素的水解產(chǎn)物中含量最多的就是由多種戊糖和己糖組成的糖類，如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖等(JonssonMartin,2016)。可以利用葡萄糖和木糖來(lái)生產(chǎn)生物燃料，化學(xué)品和聚合物，如乙醇和丁醇，為人類的生活提供所需的物品(Sims etal.,2010)。和小麥、玉米這些農(nóng)作物相比，利用玉米秸稈等纖維素類生物質(zhì)來(lái)生產(chǎn)液體燃料和生物制品，不會(huì)與現(xiàn)有耕地的糧食需求增加競(jìng)爭(zhēng)，更適應(yīng)我國(guó)目前的經(jīng)濟(jì)發(fā)展(CapolupoFaraco,2016；Qu et al.,2006)。

由于木質(zhì)纖維素其化學(xué)結(jié)構(gòu)致密復(fù)雜，且成分多樣，很難被酶直接高效水解，限制了后續(xù)的生物轉(zhuǎn)化，所以要對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，破壞其組分之間的結(jié)構(gòu)。對(duì)纖維素類生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理不僅可以提高酶水解效率，而且可以促進(jìn)后續(xù)酶解糖化過程中纖維素酶與底物的結(jié)合，是降低生產(chǎn)成本必不可少的環(huán)節(jié)(OctaveThomas,2009)。預(yù)處理方法主要有：物理法、生物法、化學(xué)法和物理化學(xué)法。物理法主要是通過機(jī)械粉碎、超聲震蕩、高溫蒸煮等方法破壞木質(zhì)素和半纖維素的結(jié)合層。化學(xué)法是用各種化學(xué)試劑進(jìn)行堿處理、酸處理、氧化劑處理等，溶解脫去木質(zhì)素，提高纖維素酶解效率。物理化學(xué)方法是結(jié)合物理、化學(xué)的方法破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，是最具有產(chǎn)業(yè)化前景方法之一。生物法是利用微生物或者其產(chǎn)生的酶來(lái)降解木質(zhì)素和半纖維素(Silveira et al.,2015)。在實(shí)際使用過程中，一般是將上述某些方法結(jié)合使用，以達(dá)到最佳的預(yù)處理效果。目前，稀酸處理是預(yù)處理中較為成熟的方法，試劑價(jià)格低廉，過程簡(jiǎn)易，反應(yīng)效率高(Saha,2003)。

木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)在預(yù)處理過程中，不僅本身的復(fù)雜結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，而且會(huì)過度降解，從而產(chǎn)生對(duì)微生物有毒性的物質(zhì)，這些物質(zhì)統(tǒng)稱為抑制物。這些小分子化合物不僅會(huì)抑制糖化步驟中纖維素酶的水解效率(Jing et al.,2009)，也會(huì)對(duì)發(fā)酵菌株的生長(zhǎng)代謝及產(chǎn)物生成等產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制作用(Wang et al.,2016)。此外，各種抑制物對(duì)發(fā)酵的抑制有協(xié)同作用，抑制物的組合可以極大地阻礙發(fā)酵(Coz et al.,2016)。根據(jù)木質(zhì)纖維素原料種類和預(yù)處理?xiàng)l件的不同，抑制物主要分為以下幾類:呋喃類(糠醛和5-羥甲基糠醛等)，弱酸類(乙酰丙酸、甲酸和乙酸等)，酚類(香草醛、香草酸和紫丁香醛等)(Chandel et al.,2013)。