[發明專利]一種用于病毒檢測的高通量液相懸浮式生物芯片及其制備方法

在審

• 申請號: 202110352933.7
• 申請日: 2021-04-01
• 公開（公告）號: CN114397446A
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 李育修
• 申請（專利權）人: 蘇州育德揚生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/576;G01N33/551;G01N33/548;G01N33/545;G01N33/58;C08F251/02;C08F220/56;C08F222/38;G01N21/64
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 王熙文

1.一種用于病毒檢測的高通量液相懸浮式生物芯片，其特征在于，包括懸浮介質以及均勻分散在懸浮介質中的多功能微球；所述多功能微球包括無機/聚合物復合微球以及包被在所述無機/聚合物復合微球表面的生物探針；所述無機/聚合物微球包括石墨烯納米片、分散在石墨烯納米片表面的石墨烯量子點殼層以及修飾在所述石墨烯量子點殼層表面的聚合物層；所述聚合物層為羧基化的納米纖維素晶體/聚丙烯酰胺二元網絡凝膠層。

2.根據權利要求1所述的一種用于病毒檢測的高通量液相懸浮式生物芯片，其特征在于，所述生物探針為所述生物探針為病毒抗原、抗體中的一種或兩種混合。

3.根據權利要求1至2任一所述的一種用于病毒檢測的高通量液相懸浮式生物芯片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將石墨烯量子點溶液和石墨烯納米片分散液混合500-1000W下超聲處理30-120min，制得復合分散液；

(2)將微晶纖維素與硫酸溶液混合攪拌均勻后，以1℃/min的速率升溫至40℃反應1-2h，反應結束后加入去離子水終止反應，得到的反應液離心處理，離心得到的沉淀重新分散后制得的分散液在-10～-20℃下冷凍干燥10-20h，制得納米纖維素晶體；

(3)將上述制得的納米纖維素晶體分散于去離子水中，然后加入TEMPO、NaBr，攪拌溶解后加入次氯酸鈉溶液，并添加堿液調節pH至10-11,反應至pH無變化后滴加乙醇終止反應，離心收集上清液，將上清液-10～-20℃下冷凍干燥10-24h，制得羧基化纖維素納米晶體；

(4)將羧基化納米纖維素晶體加入到復合分散液中，繼續加入丙烯酰胺、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺，升溫至70-80℃，加入過硫酸鉀，攪拌反應2-5h，反應結束后冷卻至室溫，將反應液冷凍干燥處理，制得多功能微球；

(5)將多功能微球分散去去離子水中制得分散液，然后加入磷酸二氫鈉和5mol/L氫氧化鈉溶液的混合液進行攪拌分散，之后加入濃度為50mg/ml的EDC和50mg/ml S-NHS的PBS溶液，繼續攪拌分散處理，加入探針，10℃、500rpm下震蕩處理并在遮光條件下孵育處理10-12h，結束后采用細胞洗滌液洗滌除去微被包被的探針，加入細胞封閉液，遮光封閉反應20-30min，制得高通量液相懸浮式生物芯片。

4.根據權利要求3所述的一種用于病毒檢測的高通量液相懸浮式生物芯片的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述石墨烯量子點溶液的濃度為0.01-0.05g/ml，所述石墨烯納米片分散液的濃度為0.01-0.05g/ml，二者體積比為1:1。

5.根據權利要求3所述的一種用于病毒檢測的高通量液相懸浮式生物芯片的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述硫酸溶液的濃度為60-65wt％，所述微晶纖維素、硫酸溶液、去離子水的用量比為4-5g：(90-100)ml：(500-1000)ml。

6.根據權利要求3所述的一種用于病毒檢測的高通量液相懸浮式生物芯片的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述次氯酸鈉溶液的濃度為10wt％，所述納米纖維素晶體、去離子水、TEMPO、NaBr、次氯酸鈉溶液、乙醇的用量比為1g：100ml：0.07g：(0.17-0.18)g：(40-50)ml：50ml。

7.根據權利要求3所述的一種用于病毒檢測的高通量液相懸浮式生物芯片的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，所述羧基化納米纖維素晶體、復合分散液、丙烯酰胺、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸鉀的用量比為3g：(50-100)ml：(2-5)g：(0.1-0.2)g：0.01g。

8.根據權利要求3所述的一種用于病毒檢測的高通量液相懸浮式生物芯片的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，所述分散液的濃度為1.25-1.55×10⁶個/ml，所述混合液中磷酸二氫鈉和氫氧化鈉溶液的的用量比為3g：2ml，所述分散液、混合液、EDC和S-NHS的PBS溶液、細胞封閉液的用量比為1：1:0.1:1.5。

9.根據權利要求3所述的一種用于病毒檢測的高通量液相懸浮式生物芯片的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，所述細胞洗滌液是由0.73g十二水合磷酸氫二鈉、1.62g氯化鈉、0.05g磷酸二氫鉀、0.04g氯化鉀、0.1ml吐溫20、200ml超純水組成；所述細胞封閉液包括0.73g十二水合磷酸氫二鈉、1.62氯化鈉、0.05g磷酸二氫鉀、0.04g氯化鉀、2g牛血清蛋白、0.04g硫柳汞和200ml超純水組成。