[發明專利]一種促進神經干細胞向神經元分化的長鏈非編碼RNA及其篩選方法

有效

• 申請號: 202110351697.7
• 申請日: 2021-03-31
• 公開（公告）號: CN113122536B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發明（設計）人: 金國華;單柏權;李雯;秦建兵;成翔;趙荷艷;田美玲;何輝;張新化
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12Q1/6809;C12Q1/02
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 宮建華

1.一種長鏈非編碼RNA在制備促進神經干細胞向神經元分化的藥物中的應用，其特征在于，所述長鏈非編碼RNA為lncRNA?Loc102556004或lncRNA?Loc102549726，所述lncRNALoc102556004或lncRNA?Loc102549726通過慢病毒轉染至神經干細胞，可明顯促進分化的神經干細胞中神經元標志物Tuj1和MAP2蛋白表達。

2.一種促進神經干細胞向神經元分化的長鏈非編碼RNA的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟(1)、制備中樞神經系統損傷大鼠模型——切割大鼠穹隆海馬傘，術后1周分離模型大鼠海馬和正常大鼠海馬組織，提取海馬外泌體；

步驟(2)、通過外泌體與神經干細胞共培養的方法，與正常對照組比較，驗證神經損傷組海馬外泌體是否可以促進神經干細胞向神經元分化；

步驟(3)、對神經損傷組和正常對照組外泌體進行高通量全轉錄組測序，構建長鏈非編碼RNA的差異表達譜；

步驟(4)、選取差異表達倍數大于2且P0.05的上調lncRNA進行驗證；

步驟(5)、重新提取神經損傷大鼠模型海馬外泌體，用Real-time?PCR方法對生物信息學分析的差異lncRNA進行驗證；

步驟(6)、用Real-time?PCR技術對胚胎腦組織中生物信息學分析的差異lncRNA進行檢測；

步驟(7)、選取與全轉錄組測序趨勢相一致、同時又在胚胎中樞神經系統中高表達的lncRNA，進行促進神經干細胞向神經元分化的實驗；選取促進神經干細胞向神經元分化的長鏈非編碼RNA，包括lncRNA?Loc102556004和lncRNA?Loc102549726進行實驗。

3.一種驗證權利要求2所述篩選方法所篩選的長鏈非編碼RNA有效性的方法，包括以下步驟：

S1、在體外神經干細胞培養中，將所選lncRNA?Loc102556004和lncRNA?Loc102549726通過慢病毒轉染至神經干細胞，培養1周后進行相關的檢測；

S2、應用Real-time?PCR技術檢測神經元標記物Tuj1和MAP2?mRNA的表達水平，并與正常對照組Tuj1和MAP2?mRNA的表達水平進行比較；

S3、應用Western?blot方法觀察神經元標記物Tuj1和MAP2蛋白的表達水平，并與正常對照組Tuj1和MAP2蛋白的表達水平進行比較；

S4、應用流式技術，檢測Tuj1陽性神經元占所分化神經干細胞的比例，并與正常對照組Tuj1陽性神經元占所分化細胞的比例比較；

S5、應用免疫熒光技術，檢測神經元標記物Tuj1和MAP2陽性神經元占所分化細胞的百分比，并與正常對照組中Tuj1和MAP2陽性神經元占所分化細胞的百分比進行比較；

S6、將上述指標數據進行統計學分析。