[發明專利]用于血液樣本熒光PCR的免提取試劑及其應用

有效

• 申請號: 202110349522.2
• 申請日: 2021-03-31
• 公開（公告）號: CN112921075B
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 劉鳳麟;劉林;汪元濤;楊琴;王文斌;李麗瓊;張喆
• 申請（專利權）人: 武漢友芝友醫療科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 彭月

一種用于血液樣本熒光PCR的免提取試劑，具體包括：血液稀釋液和PCR反應液，該免提取試劑與血液樣品構成PCR反應體系，其中，血液稀釋液中醇類物質為PEG200，堿性物質為NaOH；且血液稀釋液中各物質在血液稀釋液中的濃度分別為：PEG200含量為0.01wt％～0.1wt％，NaOH含量為10mM～100mM，Tris?HCl含量為5mM～50mM，Tween類非離子型表面活性劑含量為0.1wt％～1wt％。本發明中的免提取試劑能夠獲得預料不到的體系穩定性和降低血液中抑制物干擾能力，提升了測試結果的準確性，其中免提取試劑能夠使得血液中各種抑制物充分變性，后續PCR體系對抑制物的耐受能力得到有效提升。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體而言，本發明涉及適用于Taq man SNP分型的血液直接熒光PCR擴增的免提取試劑和應用方法。

背景技術

近年來，熒光PCR技術以其快速、準確、簡便的特點，在臨床及檢驗檢疫等領域得到了越來越廣泛的應用。Taq man SNP分型技術是熒光PCR技術的重要應用之一，廣泛應用于病原體耐藥突變檢測、遺傳病檢測、優生優育、腫瘤靶向藥物靶點檢測等方面，已經成為分子診斷和臨床檢驗的一種重要技術手段，并且在臨床得到了廣泛的推廣。

人類基因組DNA是臨床Taq man SNP分型檢測的一種重要的分析樣本，血液是其臨床常用的重要生物來源。而血液中含有大量的DNA聚合酶抑制物，如血紅素、蛋白質、脂肪等，會嚴重干擾PCR檢測的準確性，故為了可以進行Taq man SNP分型檢測，現有技術往往采用先對血液中的核酸進行提取和純化，再進行PCR檢測的方式，如酚-氯仿提純法、柱純化法、磁珠分離法等，都是現有常用的血液基因組DNA提取方法。雖然這些方法可以獲得高純度的DNA，但同時具有DNA損失大、操作繁瑣、容易交叉污染等弊端。即使經過改進和操作步驟的精簡，但操作中使用的提取試劑也會影響熒光PCR的效果，對操作者而言仍然需要離心、轉移等多次操作才能完成，操作過程相對復雜，存在交叉污染的風險。

現有技術中研發人員開發出了可以用于直接PCR檢測的免提取試劑。例如CN103305499B公開了一種直接擴增試劑，該直接擴增試劑1a由20mmol Tris-HCl，1.6mMMgCl₂，200uM each dNTP，50mM KCl，25mM NH₄Cl，1200ug/ml BSA，0.2％(體積百分含量)辛基苯基-聚乙烯二醇，0.2％(體積百分含量)N-辛酰基-N-甲基葡糖胺，5％(質量百分含量)PEG6000，0.3U/μl GoldTaq DNA聚合酶和水組成。將該直接擴增試劑和引物加入到血卡樣本中，進行測試，實現了免提取熒光PCR測試的目的，其中當PEG6000的濃度達到4.5％-5.5％的范圍內時可以獲得穩定系統的效果。該現有技術采用STR分型熒光PCR獲得檢測結果。由于SNP分型熒光標記相比于STR分型熒光標記，具有特異性高、結果更加可靠的技術效果，相應地對于樣品中抑制物質干擾的排除、反應體系的穩定性等要求也更高。

另外，現有技術CN109402239A公開了一種用于實時熒光定量PCR的免提取直接擴增試劑，用于呼吸道分泌物等非血液樣本中核酸檢測，而本領域中不同類型樣本中的抑制物質種類差異性極大，將該現有技術中使用的試劑用于血液中DNA進行Taq man SNP分型檢測，結果存在準確率不高的問題，可能是由于血液中干擾物質多、含量高，導致抑制物質不易有效變性造成。

為了解決以上問題，本發明期待建立一種能夠適用于Taq man SNP分型的血液直接熒光PCR擴增的免提取試劑，以獲得操作過程簡單、并檢測結果的技術效果。

發明內容

基于現有技術存在的技術問題，本發明提供一種用于血液樣本熒光PCR的免提取試劑，具體包括：血液稀釋液和PCR反應液，該免提取試劑與血液樣品構成PCR反應體系，其中，

血液稀釋液包括：醇類物質，堿性物質，Tris-HCl,Tween類非離子型表面活性劑；