[發(fā)明專利]一種基于定制的納米孔直接RNA測(cè)序逆轉(zhuǎn)錄接頭檢測(cè)全長(zhǎng)非poly(A)轉(zhuǎn)錄本的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110347673.4
• 申請(qǐng)日: 2021-03-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113025688A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 席飛虎;胡凱強(qiáng);陳凱;高鵬飛;周裕涵;顧連峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學(xué)俊

本發(fā)明名公開(kāi)了一種基于Oxford Nanopore Technologies的序列特異性直接RNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法及應(yīng)用，屬于三代高通量測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域。其構(gòu)建方法為：總RNA的提取和質(zhì)量控制；從總RNA中去除rRNA和質(zhì)量控制；設(shè)計(jì)序列特異性逆轉(zhuǎn)錄接頭的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和質(zhì)量控制；基于Oxford Nanopore Technologies的直接RNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建；序列特異性RNA的檢測(cè)。本方法重新設(shè)計(jì)ssRTA并將其應(yīng)用于基于Oxford Nanopore Technologies的直接RNA測(cè)序文庫(kù)，主要應(yīng)用于測(cè)定不帶ploy(A)尾的線性轉(zhuǎn)錄本，這是以往任何流程無(wú)法做到的。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于Oxford Nanopore Technologies的序列特異性直接RNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

基于Oxford Nanopore Technologies的直接RNA測(cè)序是目前唯一能夠直接對(duì)天然的RNA分子進(jìn)行全長(zhǎng)單分子測(cè)序的技術(shù)，其標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)構(gòu)建流程是先通過(guò)將含有Oligo d(T)的逆轉(zhuǎn)錄接頭（RTA）連接至所有3’末端具備Poly(A)結(jié)構(gòu)的待測(cè)RNA分子，接著進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA第一鏈，然后將測(cè)序接頭（RMX）連接至RTA末端后完成文庫(kù)構(gòu)建，具有超長(zhǎng)讀長(zhǎng)、單分子實(shí)時(shí)測(cè)序、直接讀取RNA分子天然堿基修飾信息等特點(diǎn)。但局限于RTA的序列，目前的方法僅能夠?qū)?’末端具備Poly(A)結(jié)構(gòu)的RNA分子測(cè)序。

本發(fā)明基于Oxford Nanopore Technologies直接RNA測(cè)序技術(shù)，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了序列特異性逆轉(zhuǎn)錄接頭（ssRTA），實(shí)現(xiàn)了專門針對(duì)不具備3’ Poly（A）結(jié)構(gòu)的RNA進(jìn)行全長(zhǎng)單分子直接測(cè)序，豐富了直接RNA測(cè)序所能檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本的種類。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種基于Oxford Nanopore Technologies的序列特異性直接RNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法及應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。

一種基于Oxford Nanopore Technologies的序列特異性直接RNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法及應(yīng)用，其特征在于，所述方法包括以下步驟：（1）總RNA的提取和質(zhì)量控制；（2）從總RNA中去除rRNA和質(zhì)量控制；（3）序列特異性逆轉(zhuǎn)錄接頭（ssRTA）的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和質(zhì)量控制；（4）基于Oxford Nanopore Technologies的直接RNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建；（5）序列特異性RNA的檢測(cè)。可選地，所述總RNA樣本來(lái)源于植物、動(dòng)物或人。

上述步驟（1），總RNA的提取和質(zhì)量控制包括：

將毛竹實(shí)生苗處理潔凈，如圖1所示。

進(jìn)一步的，用TIANGEN RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA試劑盒提取樣本總RNA。

更進(jìn)一步的，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳（6V/cm）檢測(cè)總RNA樣本降解程度，如圖2所示。

更進(jìn)一步的，用Qubit熒光計(jì)精確定量總RNA樣本。

更進(jìn)一步的，用Nanodrop 2000c分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA樣本純度，以A 260/280和A260/230表征。

更進(jìn)一步的，用Agilent 2100生物分析儀測(cè)定總RNA樣本RIN值，用RIN值 8.0的樣本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如圖3所示。

上述步驟（2），從總RNA中去除rRNA和質(zhì)量控制包括：

用RiboMinus^TM Plant kit for RNA-seq（ThermoFisher, Cat. No. A1083808）從總RNA樣本中去除rRNA，得到Ribo- RNA樣本。

進(jìn)一步的，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳（6V/cm）檢測(cè)去除rRNA效果，如圖4所示。