[發明專利]一種具有SPVD抗性甘薯的育種方法

有效

• 申請號: 202110346271.2
• 申請日: 2021-03-31
• 公開（公告）號: CN113249403B
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發明（設計）人: 余益成;孫健;李艷娟;李宗蕓
• 申請（專利權）人: 江蘇師范大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/55;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 江蘇斐多律師事務所 32332
• 代理人: 袁敏

1.一種具有SPVD抗性甘薯的育種方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）獲得轉基因甘薯的植物表達載體，采用在常規三元植物表達載體?pCambia1380中插入RfxCas13d序列及對應靶向SPCSV-RNase3的靶標序列；

（2）將步驟（1）構建獲得的載體通過化學法進行農桿菌菌株EHA105的轉化；

（3）將步驟（2）轉化獲得的轉基因陽性甘薯進行分選擴繁;

（4）對所獲得的轉基因甘薯的病毒抗性進行鑒定；

其中，所述常規三元植物表達載體?pCambia1380載體中已預先構建了表達HYG潮霉素的表達框用于對轉基因陽性的植物進行篩選和轉基因陽性鑒定;

所述的步驟（1）構建方法包含了2段不同的序列表達框；分別為使用pNbU4啟動子驅動RfxCas13d蛋白基因表達，使用pAtU6啟動子驅動靶向SPCSV-RNase3的Spacer表達；

其中，所述的pAtU6啟動子驅動表達采用了優化的引導序列gRNA，所述的引導序列gRNA核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

2.如權利要求1所述的具有SPVD抗性甘薯的育種方法，其特征在于，所述的構建方法采用了分段克隆的方式對植物表達載體?pCambia1380進行構建。

3.如權利要求2所述的具有SPVD抗性甘薯的育種方法，其特征在于，所述構建方法在于，先將pCambia1380載體分別使用HindIII/EcoRI;KpnI/BamHi限制性內切酶進行切開，后分別插入包含有RfxCas13d的序列表達框及包含gRNA片段的表達框；所述的gRNA包含靶向SPCSV-RNase3基因的Spacer及Poly?T的DNA片段；所述的gRNA片段的表達框使用pAtU6啟動子驅動表達；最后利用同源重組的連接方式進行載體克隆連接以獲得對應的用于遺傳轉化的甘薯表達載體。

4.如權利要求3所述的具有SPVD抗性甘薯的育種方法，其特征在于，所述的包含有RfxCas13d的序列表達框利用軟件OptimumGene進行了密碼子偏好性優化并進行對于核酸片段合成。

5.如權利要求4所述的具有SPVD抗性甘薯的育種方法，其特征在于，所述的偏好性優化采用雙子葉植物。

6.如權利要求1所述的具有SPVD抗性甘薯的育種方法，所述步驟（2）包括如下步驟：

將步驟（1）構建完成的載體加入農桿菌EHA105感受態細胞中，經過冰浴、液氮冷凍、熱激、搖菌和涂布平板的步驟，在28度培養箱培養48h，挑選PCR鑒定為陽性的單克隆菌落；使用YEB液體培養基進行過夜搖菌，將獲得的濃度OD600=0.6的農桿菌菌液侵染已預先制備完成的甘薯愈傷細胞。

7.如權利要求1所述的具有SPVD抗性甘薯的育種方法，其特征在于，步驟（3）具體為：將步驟（2）轉化獲得的抗HYG胚性愈傷細胞轉化至甘薯分化培養基MS后培養60天，并利用PCR鑒定法對獲得的轉基因甘薯植株進行抗性陽性鑒定；所述的抗HYG胚性愈傷細胞中HYG濃度為20mg/L。

8.如權利要求1所述的具有SPVD抗性甘薯的育種方法，其特征在于，所述步驟（4）采用蟲媒傳播及嫁接傳播的方式進行抗性驗，實驗結果表明，和對照組相比，該種轉基因甘薯可以有效抑制長期蟲媒傳播和短期嫁接后導致的病毒積累；所述的長期為90d;所述的短期為15d；所述的病毒為SPFMV/SPCSV。