[發(fā)明專利]一種脫細(xì)胞基質(zhì)支架的制備方法及通過該方法獲得的脫細(xì)胞基質(zhì)支架

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110342912.7
• 申請(qǐng)日: 2021-03-30
• 公開（公告）號(hào): CN113082294A
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 凌友;陳俊霖;梁志豪;黃斯坦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 冠昊生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): A61L27/36
• 分類號(hào): A61L27/36;A61L27/56
• 代理公司: 北京捷誠信通專利事務(wù)所(普通合伙) 11221
• 代理人: 萬善書

本發(fā)明公開了一種脫細(xì)胞基質(zhì)支架的制備方法及通過該方法獲得的脫細(xì)胞基質(zhì)支架，制備方法包括：交聯(lián)步驟：將經(jīng)脫細(xì)胞處理的天然軟骨基質(zhì)注入模具中冷凍干燥后進(jìn)行紫外交聯(lián)4?8h，然后加入EDC和NHS的混合溶液再進(jìn)行交聯(lián)20?24h，清洗并冷凍干燥、滅菌，得到脫細(xì)胞基質(zhì)支架；脫細(xì)胞基質(zhì)支架通過上述的制備方法得到；該方法以紫外交聯(lián)結(jié)合EDC和NHS的混合溶液的雙交聯(lián)方式，配合凍干工藝，提高了支架表面孔隙的均勻和致密性，能提升細(xì)胞在材料表面的附著、生長情況。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種脫細(xì)胞基質(zhì)支架的制備方法及通過該方法獲得的脫細(xì)胞基質(zhì)支架，屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

軟骨組織是由膠原組織、少許細(xì)胞、以及60-80％的水份等成份所構(gòu)成，成人的軟骨組織中并沒有血管或神經(jīng)，因此軟骨組織受傷后自行修補(bǔ)的能力有限。

軟骨組織工程的出現(xiàn)使人類可以通過人工手段在體內(nèi)外建造出透明軟骨，為關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)提供了一條頗具前途的方法。關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)方式有通過一些天然材料和合成材料制備成各種支架而用于軟骨組織修復(fù)中，但是天然材料的生物力學(xué)強(qiáng)度低，合成材料生物相容性差。進(jìn)一步地，更偏向于使用異種脫細(xì)胞基質(zhì)支架，其制備主要是利用化學(xué)法進(jìn)行脫細(xì)胞后再成型，但該方法脫細(xì)胞效果一般、且對(duì)膠原提取程度不高、制備的支架對(duì)于軟骨分化、維持其結(jié)構(gòu)和透明軟骨表型穩(wěn)定的微環(huán)境方面仍表現(xiàn)欠缺。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種脫細(xì)胞基質(zhì)支架的制備方法，該方法以紫外交聯(lián)結(jié)合EDC和NHS的混合溶液的雙交聯(lián)方式，配合凍干工藝，提高了支架表面孔隙的均勻和致密性，能提升細(xì)胞在材料表面的附著、生長情況。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供通過上述制備方法所獲得的脫細(xì)胞基質(zhì)支架，脫細(xì)胞基質(zhì)支架具有良好的空間仿生結(jié)構(gòu)，能夠很好地促進(jìn)細(xì)胞生長。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一個(gè)目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種脫細(xì)胞基質(zhì)支架的制備方法，包括：

交聯(lián)步驟：將經(jīng)脫細(xì)胞處理的天然軟骨基質(zhì)注入模具中冷凍干燥后進(jìn)行紫外交聯(lián)4-8h，然后加入EDC和NHS的混合溶液再進(jìn)行交聯(lián)20-24h，清洗并冷凍干燥、滅菌，得到脫細(xì)胞基質(zhì)支架。

進(jìn)一步地，交聯(lián)步驟中，兩次冷凍干燥的條件均為溫度-60℃，時(shí)間24-48h。

進(jìn)一步地，交聯(lián)步驟中，EDC和NHS的混合溶液以95vt％乙醇溶液作為溶劑，EDC和NHS的濃度為2mol/L。

進(jìn)一步地，交聯(lián)步驟中，滅菌為以鈷60進(jìn)行輻照滅菌。

進(jìn)一步地，交聯(lián)步驟前還包括脫細(xì)胞步驟：

將天然關(guān)節(jié)軟骨粉碎，加入HCl溶液并在溫度為4-26℃的條件下震蕩混勻后取沉淀，將沉淀清洗；在沉淀中加入蛋白酶溶液，溫度為4-26℃的條件下攪拌96-120h，然后加入NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，離心取上清；在上清中加入NaCl溶液，進(jìn)行差速離心，每一次離心后除去部分上清液，最后一次離心后除去全部上清液，取沉淀物；將沉淀物進(jìn)行透析，得到經(jīng)脫細(xì)胞處理的天然軟骨基質(zhì)。

進(jìn)一步地，脫細(xì)胞步驟中，HCl溶液的濃度為2-4mol/L；震蕩混勻的時(shí)間為24-48h；蛋白酶溶液的濃度為1-3g/L；NaOH溶液的濃度為1mol/L；NaCl溶液的濃度為1-4mol/L。

進(jìn)一步地，脫細(xì)胞步驟中，差速離心為第一次離心的轉(zhuǎn)速為2000-3000r/min，離心后除去50％上清液；第二次離心的轉(zhuǎn)速為4000-5000r/min，離心后除去50％上清液；第三次離心的轉(zhuǎn)速為6000-7000r/min，離心后除去50％上清液；第四次離心的轉(zhuǎn)速為9000-12000r/min，離心后除去全部上清液。