[發明專利]中性蛋白酶突變體及其構造方法和應用

有效

• 申請號: 202110342503.7
• 申請日: 2021-03-30
• 公開（公告）號: CN113151329B
• 公開（公告）日: 2023-09-08
• 發明（設計）人: 黃遵錫;楊正鳳;韓楠玉;胡懋;魏婷柳
• 申請（專利權）人: 云南師范大學
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/62;C12N15/81;C12N15/10;C12R1/84
• 代理公司: 北京中仟知識產權代理事務所(普通合伙) 11825
• 代理人: 田江飛

一種復合位點突變體NPI?D632G/A633V；其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。一種熱穩定性提高的中性蛋白酶NPI的復合位點突變體NPI?D632G/A633V?LANT326?329VSSS；其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

技術領域

本發明涉及基因工程、酶工程的蛋白分子改造領域，特別涉及定向改造熱穩定性提高的中性蛋白酶突變體及其構造方法。

背景技術

中性蛋白酶是指在對蛋白質在中性條件下具有較好水解效果的蛋白酶，因其無工業污染、催化反應速度快和催化反應條件適應性寬等特點，使其在洗滌劑、毛皮軟化、化妝品、絲紡、食品、制藥等行業都具有廣泛應用。

溫度對酶促反應的作用效率具有關鍵作用，熱穩定性的優良決定了酶對底物的催化效果的可持續性，但大多中性蛋白酶的耐熱性較差，生產與使用條件復雜，這極大的限制了其的工業化應用，所以通過一定的手段策略提高中性蛋白酶的熱穩定性，是目前中性蛋白酶產業化應用中亟待解決的問題。定點突變是一種有效的蛋白分子改造，被廣泛應用于酶性質的改良和酶活性的提高等方面。

發明內容

為解決上述現有技術存在的問題，本發明的目的在于提供定向改造熱穩定性提高的中性蛋白酶突變體及其構造方法。

為達到上述目的，本發明的技術方案為：

一種復合位點突變體NPI-D632G/A633V；其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

一種熱穩定性提高的中性蛋白酶NPI的復合位點突變體NPI-D632G/A633V-LANT326-329VSSS；其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

進一步的，他們的最適pH為7，最適溫度為55℃。

所述突變體的突變方法，其步驟如下：

(1)中性蛋白酶基因NPI的序列優化及克隆：利用DNAwork對NPI進行畢赤酵母表達的序列優化后直接合成目的序列，以此序列為模板進行PCR擴增，將產物連接到pPIC9K載體上，得到重組載體pPIC9K-NPI；

(2)定點突變：以載體pPIC9K-NPI為模板，以相應的突變引物進行PCR擴增、消化；將消化產物以熱激法轉入DMT感受態細胞，經菌液PCR驗證后送測序，確定正確的突變子提取質粒后經SalI限制性內切酶，以電轉法轉入畢赤酵母GS115進行表達。

進一步的，所述突變方法的突變引物為：

NPI-D632G/A633V-F

5'-GTTACTACTCCTCAAAGATCTGACGAAGAGTACC-3'

NPI-D632G/A633V-R

5'-AGATCTTTGAGGAGTAGTAACAGCAGAACCTTTAGAAGCTGCC-3'

NPI-D632G/A633V-LNAT326-329VSSS-F

5'-GTAAGATTTCAAGTAGATTTGTCCAAAACAC-3'

NPI-D632G/A633V-LNAT326-329VSSS-R

5'-TCTACTTGAAATCTTACTTGCTGCTTCAAC-3'

進一步的，所述突變體在中性蛋白酶NPI熱穩定性提高方面的應用。

相對于現有技術，本發明的有益效果為：