[發明專利]用于檢測糖類抗原的基于志賀毒素B亞基重組蛋白的探針、制備方法

有效

• 申請號: 202110338813.1
• 申請日: 2021-03-30
• 公開（公告）號: CN113087807B
• 公開（公告）日: 2022-06-17
• 發明（設計）人: 施杰;吳志猛;陸仲鍇
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/13;C12P21/02;G01N33/574;G01N33/58
• 代理公司: 無錫承果知識產權代理有限公司 32373
• 代理人: 劉清麗

1.一種用于檢測糖類抗原的基于志賀毒素B亞基重組蛋白的探針，其特征在于：所述糖類抗原為Gb3，該探針由以下兩個部分偶聯形成：

a、生物素化志賀毒素B亞基重組蛋白，

b、鏈霉親和素標記量子點；

其中，所述生物素化志賀毒素B亞基重組蛋白由以下組分經體外酶法融合修飾獲得：

c、志賀毒素B亞基重組蛋白，

d、生物素化短肽；

其中，所述志賀毒素B亞基重組蛋白由志賀毒素B亞基蛋白經羧基端修飾獲得， 所述羧基端修飾為：在所述志賀毒素B亞基蛋白的羧基端修飾Myc標簽、轉肽酶A識別位點、His標簽序列；

所述志賀毒素B亞基蛋白為志賀毒素1B亞基蛋白或志賀毒素2B亞基蛋白；

所述生物素化短肽為含有生物素基團的短肽，所述短肽的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述體外酶法融合修飾的方法為，以包含Tris、NaCl、CaCl₂的pH7.5 PBS緩沖液為酶反應體系，在所述酶反應體系中加入志賀毒素B亞基重組蛋白、生物素短肽及轉肽酶A，于4-25℃振蕩反應1-5h獲得所述生物素化志賀毒素B亞基重組蛋白；

所述志賀毒素2B亞基重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述志賀毒素1B亞基重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

2.根據權利要求1所述的用于檢測糖類抗原的基于志賀毒素B亞基重組蛋白的探針，其特征在于：所述生物素化短肽包括短肽和至少一個生物素分子，所述短肽為含有甘氨酸標簽的多肽，所述生物素分子為任意可結合鏈霉親和素的生物素類似物。

3.根據權利要求1所述的用于檢測糖類抗原的基于志賀毒素B亞基重組蛋白的探針，其特征在于：所述酶反應體系中包含50 mM Tris、150 mM NaCl、5 mM CaCl₂的pH6.0-8.0 PBS緩沖液。

4.根據權利要求1所述的用于檢測糖類抗原的基于志賀毒素B亞基重組蛋白的探針，其特征在于：在所述酶反應體系中加入所述志賀毒素B亞基重組蛋白的濃度為10-50 μM，所述生物素短肽的濃度為300-400 μM，所述轉肽酶A的濃度為2-5 μM。

5.根據權利要求1所述的用于檢測糖類抗原的基于志賀毒素B亞基重組蛋白的探針，其特征在于：所述探針的制備方法為，生物素化志賀毒素B亞基重組蛋白、鏈霉親和素標記量子點的偶聯探針混合于pH6.0-8.0 PBS緩沖液中，4-25℃下避光，振蕩反應30 min-2 h。

6.根據權利要求5所述的用于檢測糖類抗原的基于志賀毒素B亞基重組蛋白的探針，其特征在于：所述生物素化志賀毒素B亞基重組蛋白濃度為1 μM；所述鏈霉親和素標記量子點的濃度為5-50 nM，振蕩轉速為10-200 rpm。

7.根據權利要求1-6任一所述的用于檢測糖類抗原的基于志賀毒素B亞基重組蛋白的探針的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

1）志賀毒素B亞基重組蛋白的原核表達和純化；

2）生物素短肽的制備；

3）所述志賀毒素B亞基重組蛋白與生物素化短肽的體外酶法融合修飾，得生物素化志賀毒素B亞基重組蛋白；

4）所述生物素化志賀毒素B亞基重組蛋白與鏈霉親和素標記量子點進行偶聯，制備得所述探針。