[發明專利]一種新的合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的方法

有效

• 申請號: 202110338722.8
• 申請日: 2021-03-30
• 公開（公告）號: CN113214376B
• 公開（公告）日: 2023-09-19
• 發明（設計）人: 齊昀坤;王金艷;劉雅妮;陳西同;馬艷楠;杜姍姍;王克威
• 申請（專利權）人: 青島大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 北京集智東方知識產權代理有限公司 11578
• 代理人: 孫文彬

1.一種新的合成蜈蚣毒素RhTx的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)稱取1當量的Rink?Amide?AM樹脂或Wang樹脂置于多肽合成管中，標準洗一次，抽干；加入3mL?DMF于室溫中浸泡溶脹1h，標準洗一次；加入3mL?DMF/DCM混合溶液，所述DMF和DCM的體積比為1:1，于28℃恒溫振蕩器中活化樹脂30min，標準洗一次；

2)在28℃恒溫振蕩條件下，加入20％哌啶的DMF溶液v/v脫除Fmoc保護基團，在28℃溫度下，在恒溫振蕩器中反應5min，DMF洗兩次；再加入20％哌啶的DMF溶液，在28℃溫度下，在恒溫振蕩器中反應10min，標準洗一次，抽干待用；

3)精氨酸之外的其它氨基酸縮合，Rink?Amide?AM樹脂使用的縮合體系是含有Fmoc-氨基酸4當量、Oxyma?4當量、DIC?8當量或12當量或16當量的3mL?DMF溶液，Wang樹脂使用的縮合體系是含有Fmoc-氨基酸4當量、Oxyma?4當量、DIC?8當量的3mL?DMF溶液；在50℃恒溫振蕩條件下縮合兩次，第一次反應10-15min，第二次根據氨基酸連接的難易程度和Kaiser檢測情況反應15-30min；然后，在50℃恒溫振蕩的條件下，使用20％哌啶的DMF溶液脫除Fmoc保護基團，第一次反應3min，第二次反應6min；

4)Fmoc-Arg(Pbf)-OH使用的縮合體系是含有Fmoc-Arg(Pbf)-OH?4當量、HCTU?3.7當量和DIEA?8當量的3mL?DMF溶液，在28℃恒溫振蕩條件下縮合，第一次反應20min，第二次反應40min，然后，在28℃恒溫振蕩條件下，使用20％哌啶的DMF溶液脫除Fmoc保護基，第一次反應5min，第二次反應10min；

5)切肽：標準洗一次，在28℃恒溫振蕩條件下，使用20％哌啶的DMF溶液脫除Fmoc保護基團，第一次反應5min，DMF沖洗兩次，再次加入20％哌啶的DMF溶液，反應10min，標準洗一次，取少量樹脂，用Kaiser試劑檢測，在加熱條件下檢測顯色，使用DCM沖洗樹脂5次，水泵抽真空5分鐘，油泵抽真空5分鐘，加入切肽試劑，28℃恒溫振蕩器中反應2.5小時；

6)多肽沉淀：使用氮氣鼓泡濃縮方法，將切肽溶液濃縮至2-3mL，使用冰乙醚沉淀，在3000r/min的條件下離心1min，棄去上清液，保留沉淀；溶解-離心-棄上清步驟重復三次；多肽沉淀在通風櫥中靜置至干燥；

7)分離純化：通過制備型反相高效液相色譜對線性肽進行分離純化，使用乙腈-水的混合溶液溶解粗肽，使用低溫冷凍干燥機冷凍干燥，然后用乙腈-水的混合溶液再次溶解粗肽，使用半制備型反相高效液相色譜分離純化，低溫冷凍干燥，得到目標線性多肽；

8)體外復性折疊和分離純化：通過氧化還原對實現線性RhTx的體外復性折疊，通過反相高效液相色譜對復性溶液進行分離純化，通過低溫冷凍干燥機凍干，得到目標毒素多肽。