[發(fā)明專利]基于標(biāo)記抗體的活細(xì)胞免疫熒光染色方法

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• 申請日: 2021-03-30
• 公開（公告）號: CN113029733A
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜云瀚
• 申請（專利權(quán)）人: 姜云瀚
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N33/533;G01N15/14
• 代理公司: 成都熠邦鼎立專利代理有限公司 51263
• 代理人: 曾克

本發(fā)明公開了基于標(biāo)記抗體的活細(xì)胞免疫熒光染色方法，包括如下步驟：A1：將活細(xì)胞免疫熒光輔助劑和opt?MEM培養(yǎng)液按體積份數(shù)比1:12.5充分混合，室溫孵育15min，得到混合液1；A2：將活細(xì)胞抗體和opt?MEM培養(yǎng)液按體積份數(shù)比1:50充分混合，室溫孵育15min，得到混合液2；A3：將混合液1和混合液2按體積份數(shù)比54:52充分混合，室溫孵育15min，得到混合液3；A4：將混合液3加入到目的細(xì)胞培養(yǎng)基中，得到混合液4，混合液3和目的細(xì)胞培養(yǎng)基體積份數(shù)比為53:100；A5：將混合液4培養(yǎng)4?6小時，用PBS溶液清洗2?3次，完成染色。本發(fā)明不需要進(jìn)行細(xì)胞膜打孔，利用抗體，使得活細(xì)胞的熒光染色范圍和固定細(xì)胞免疫熒光染色范圍一樣；同時，該方法只需要4?6個小時即可，時間明顯縮短。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫分析和生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及基于標(biāo)記抗體的活細(xì)胞免疫熒光染色方法。

背景技術(shù)

目前國內(nèi)的活細(xì)胞染色方法包括：1、中國專利“活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法”，專利號“201410061287.9”，該方法利用脂質(zhì)體作為載體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，方法需要22-26個小時且只針對直接帶有熒光標(biāo)記的抗體；2、中國專利“一種活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫熒光標(biāo)記方法”，專利號“201910633999.6”，該方法對細(xì)胞活性有一定的影響，且染色效率不高。

目前常規(guī)的活細(xì)胞的染色一般通過化學(xué)熒光染料實(shí)現(xiàn)，化學(xué)熒光染料進(jìn)行染色的范圍非常有限，且不是蛋白質(zhì)特異性而是化學(xué)結(jié)構(gòu)特異性的。目前常規(guī)的熒光染色一般通過細(xì)胞膜打孔實(shí)現(xiàn)，細(xì)胞膜打孔會影響細(xì)胞活性，容易造成細(xì)胞死亡，增加細(xì)胞碎片的產(chǎn)生，影響流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果。目前常規(guī)的熒光染色時間也比較長，影響實(shí)驗(yàn)的效率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種基于標(biāo)記抗體的活細(xì)胞免疫熒光染色方法，不需要進(jìn)行細(xì)胞膜打孔，利用抗體，使得活細(xì)胞的熒光染色范圍和固定細(xì)胞免疫熒光染色范圍一樣；同時，該方法只需要4-6個小時即可，時間明顯縮短。

本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：基于標(biāo)記抗體的活細(xì)胞免疫熒光染色方法，包括如下步驟：

A1：將活細(xì)胞免疫熒光輔助劑和opt-MEM培養(yǎng)液按體積份數(shù)比0.5-1.5:12-13充分混合，室溫孵育10-15min，得到混合液1；

A2：將活細(xì)胞抗體和opt-MEM培養(yǎng)液按體積份數(shù)比0.5-1.5:45-55充分混合，室溫孵育10-15min，得到混合液2；

A3：將混合液1和混合液2按體積份數(shù)比50-55:50-55充分混合，室溫孵育10-15min，得到混合液3；

A4：將混合液3加入到目的細(xì)胞培養(yǎng)基中，得到混合液4，所述混合液3和目的細(xì)胞培養(yǎng)基體積份數(shù)比為50-55:100；

A5：將混合液4培養(yǎng)4-6小時，用PBS溶液清洗2-3次，完成染色。

進(jìn)一步，包括如下步驟：

A1：將活細(xì)胞免疫熒光輔助劑和opt-MEM培養(yǎng)液按體積份數(shù)比1:12.5充分混合，室溫孵育15min，得到混合液1；

A2：將活細(xì)胞抗體和opt-MEM培養(yǎng)液按體積份數(shù)比1:50充分混合，室溫孵育15min，得到混合液2；

A3：將混合液1和混合液2按體積份數(shù)比54:52充分混合，室溫孵育15min，得到混合液3；

A4：將混合液3加入到目的細(xì)胞培養(yǎng)基中，得到混合液4，所述混合液3和目的細(xì)胞培養(yǎng)基體積份數(shù)比為53:100；

A5：將混合液4培養(yǎng)4-6小時，用PBS溶液清洗2-3次，完成染色。

進(jìn)一步，所述步驟A2中，活細(xì)胞抗體為細(xì)胞核內(nèi)蛋白一抗和二抗混合物，一抗和二抗的重量份數(shù)比為1:1。

進(jìn)一步，所述步驟A2中，活細(xì)胞抗體為熒光標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)蛋白抗體。

進(jìn)一步，所述步驟A1中，所述活細(xì)胞免疫熒光輔助劑的制備方法，包括如下步驟：